大肠埃希菌是消化内科患者最常见的致病菌之一^[1]，近些年来随着抗生素的使用，大肠埃希菌的耐药性逐渐加重，临床治疗也显得越来越困难^[2]。同时，作为消化内科患者胆汁中分离首位的细菌^[3]，其耐药性直接影响到患者临床住院时间、治疗费用及预后，既为治疗带来挑战，也增加了患者的经济负担^[4]。氟喹诺酮类抗生素一直是临床医生治疗大肠埃希菌胆道感染最常见的药物之一，近年来随着耐药性的广泛传播，尤其是质粒介导的氟喹诺酮类耐药基因(PMQR)的出现，使临床针对氟喹诺酮类药物的选择性大大降低，同时地区性的传播也给临床流行病学资料的调查带来了严峻的考验^[5]。在此基础上，笔者通过对消化内科患者胆汁分离的大肠埃希菌耐药特点及PMQR基因分布的调查，探究胆道感染大肠埃希菌的耐药传播特性及分子流行病学特点。

收集2011年1月至2013年6月开化县第二人民医院消化内科各种标本分离的非重复大肠埃希菌(经鉴定)724株作为实验菌株，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922(本室保存)。

Vitek 2 compact全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)、 PCR仪(德国Eppendorf公司)、电泳仪(美国BIO. RAD公司)、凝胶成像系统(北京六一公司)。

PCR试剂(批号：20140123)和DNA Marker I(批号：20140S10) 购于TaKaRa大连宝生物公司，PMQR耐药基因扩增引物参照文献设计^[6]，由上海生工生物技术有限公司合成，产物纯化后送上海生工生物技术有限公司测序。

质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，细菌鉴定和药物敏感性试验采用Vitek 2 compact全自动细菌鉴定仪，抗菌药敏结果按CLSI 2012年标准判定。采用双纸片法确认产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株。

采用煮沸法提取大肠埃希菌基因组DNA，PCR扩增反应体系体积为25 μl，上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μl，dNTP (100 mmol/L)2 μl，模板DNA 3 μl，MgCl₂ (25 mmol/L)1.5 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，EX Taq酶(5 U/μl)0.125 μl，ddH₂O 14.375 μl，混匀后离心置PCR仪上进行扩增反应。循环参数为：94 ℃预变性 5 min，然后94 ℃ 30 s →53 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

PCR产物在1.2%的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中进行电泳后，用凝胶成像系统观察结果，并将阳性扩增产物送上海生工生物有限公司测序，并在GenBank (http：//www.ncbi.nlm.nih.go/blast/)进行比对分析。 1.7 统计学分析 药敏资料采用Whonet 5.4软件进行分析，并采用SPSS 17.0软件进行 χ ²检验。

分析浙江省衢州市开化县第二人民医院消化内科分离大肠埃希菌共724株，其中135株来自胆汁，325株来自痰液，152株来自血液，43株来自引流液，52株来自分泌物，27株来自其他标本类型。胆源性大肠埃希菌的耐药性普遍低于非胆源性大肠埃希菌，然而其环丙沙星和左氧氟沙星的耐药性要高于非胆源性菌株，但所有大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的敏感率均为100%，结果见表1。

对135株胆源性大肠埃希菌的PMQR基因进行PCR检测及测序，结果显示：121株 (89.6%) qnrA1 基因阳性，45株(33.3%) qnrB4 基因阳性，32 株(23.7%) qnrB6 基因阳性，43株(31.9%) qnrS1 基因阳性，34株(25.2%) aac (6′)-Ib-cr 基因阳性菌株，未检出 qepA 基因，PCR电泳结果见图1。

图1 阳性菌株扩增产物电泳结果 Fig.1 Electropherogram of PCR products of E. coli strains 注：1～4为 qnrS 阳性菌株； 5～6为阴性对照； 7～8为 qnrB 阳性菌株； 9为 qnrA 阳性菌株。

图选项

qnrA1+qnrB4 基因组合的阳性率最高，占33.3%，其次为 qnrA1+qnrB6和qnrA1+qnrB4+qnrS1，占23.7%和18.5%。此外，还有部分菌株携带 qnrA1+qnrB4+qnrS1+acc(6′)-Ib-cr和qnrA1+qnrB6+qnrS1+acc(6′)-Ib-cr 四种PMQR基因，分别占15.6%和8.9%。随着PMQR基因组合的增多，菌株表现出对环丙沙星和左氧氟沙星更高水平的耐药率，其中含有4种PMQR的菌株对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率高达90%以上，见表2。

氟喹诺酮类抗生素对大多数革兰阴性细菌均有较强作用，但由于广泛和过度使用，其耐药问题随之出现^[7]。PMQR基因由于其可通过质粒介导而在肠杆菌科细菌中广泛传播，导致临床氟喹诺酮类抗生素使用的限制。PMQR基因目前主要包括 qnr基因、acc(6′)-Ib-cr基因及qepA 基因等^[8]，目前主要通过质粒介导导致氟喹诺酮类抗生素低水平耐药，然而近些年来有研究显示多种PMQR基因的联合作用可导致临床上氟喹诺酮类抗生素高水平耐药，并且在同种甚至不同种细菌间广泛传播。

本研究前期对开化县第二人民医院消化内科分离的大肠埃希菌不同标本来源的菌株药敏资料分析发现，在胆源性的大肠埃希菌其对氟喹诺酮类抗菌药物表现出较高水平的耐药，而在其他标本类型中表现的耐药性稍低。为此，对该院消化内科胆汁中分离的氟喹诺酮类抗生素耐药的大肠埃希菌的耐药机制及分子流行病学进行深入的调查发现，135株胆源性大肠埃希菌携带 qnrA1 基因最高，阳性率高达89.6%，而对 qnrB、qnrS及acc(6′)-Ib-cr 基因携带率分别为57.0%、31.9%和25.2%，但是所有菌株中均未检测出 qepA 基因，与国内外相关报道相似^[9]。选取部分基因测序分析发现，qnrA 基因均为 qnrA1 型，这也是我国最为流行的基因型，与之前报道较为一致^[10]。而 qnrS 基因均为 qnrS1 型，qnrB 基因我们测序发现包括两种，qnrB4型和qnrB6 型，2种基因型分别占58.4%(45/77)和41.6%(32/77)，与我国目前报道存在一定差异^[11]。

笔者对这些基因型的组合分析发现，开化县第二人民医院胆源性大肠埃希菌携带最多的PMQR基因组合为 qnrA1+qnrB4，阳性率为33.3%，其次为 qnrA1+qnrB6 和 qnrA1+qnrB4+qnrS1，阳性率分别为23.7%和18.5%，而部分菌株携带 qnrA1+qnrB4+qnrS1+acc(6′)-Ib-cr和qnrA1+qnrB6+qnrS1+acc(6′)-Ib-cr 四种PMQR基因，分别占15.6%和8.9%，且均表现出对氟喹诺酮类抗生素的高水平耐药，最低抑菌浓度值均>256 μg/ml。随着PMQR基因组合的增多，菌株表现出对环丙沙星和左氧氟沙星更高水平的耐药率，其中含有4种PMQR的菌株更是对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率高达90%以上。表明多种PMQR基因的携带在胆源性大肠埃希菌的氟喹诺酮类耐药中发挥着重要的作用。

综上所述，对于消化内科胆源性大肠埃希菌的氟喹诺酮类耐药水平较高，且PMQR基因分布广泛，阳性率高和多种PMQR基因组合分布是造成氟喹诺酮类抗生素高水平耐药的主要原因。