2015, Vol. 30扩展功能
文章信息
- 王海萍, 陈秀丽, 周朱瑛, 李光乾
- WANG Hai-ping, CHEN Xiu-li, ZHOU Zhu-ying, LI Guang-qian
- 肠道病毒71型脑炎患儿血清和脑脊液CD40、CD40L和血管细胞黏附分子-1检测的价值
- Role of sCD40,sCD40L and vascular cell adhesion molecule-1 in serum and cerebrospinal fluid of children with EV71 encephalitis
- 疾病监测, 2015, 30(7): 534-538
- Disease Surveillance, 2015, 30(7): 534-538
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2015.07.004
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文章历史
- 收稿日期：2015-03-24
手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是肠道病毒引起的一种传染病。引起HFMD的主要致病原以柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A group 16 strain，Cox A16)和肠道病毒71型(Enterovirus A71，EV71)最为常见[1]。轻症HFMD预后良好，但重症患儿(特别是EV71感染者)可并发脑膜炎、脑炎、脑干脑炎等疾病。目前其发病机制尚不明确。近年来的研究显示免疫功能相对不足可能是儿童易患手足口病的根本原因，免疫改变可能与EV71引起的脑膜脑炎有关。CD40与CD40配体(CD40 ligand，CD40 L)是一对互补跨膜糖蛋白，是免疫和炎症反应中重要的信号转导系统[2]。二者的相互作用可调节上皮细胞表面黏附分子(如血管细胞黏附分子-1，VCAM-1；P选择素等)的表达，调节细胞表面黏附分子(如LFA-1、ICAM-1等)以及可诱导多种类型细胞(如单核细胞、平滑肌细胞及上皮细胞)表达一些前炎症因子(如IL-1、IFN-γ、TNF-α等)参与到炎症反应中来[3]。为探讨CD40、CD40L与VCAM-1在EV71脑炎发病中的作用，以及其对EV71脑炎病情严重性的影响及预后判断的价值，笔者应用ELISA方法检测了46例EV71脑炎患儿血清和脑脊液中CD40、CD40L与VCAM-1的水平，现报道如下。
1 资料与方法 1.1 临床病例来源与分组 1.1.1 临床病例来源所有病例来自于2012年3月至2013年10月在杭州市儿童医院住院的手足口病患儿，共70例，且病原学检测结果确定为EV71感染。确诊EV71感染的病原学检测方法(至少有一项检测结果为阳性):①采集肛拭子或咽拭子标本经RT-PCR检测结果为EV71核酸阳性(检测试剂由杭州新景生物试剂开发有限公司提供，生产批号20130509)；②急性期血清或脑脊液标本经ELISA法检测结果为EV71 glum阳性(检测试剂盒由北京万泰生物药业股份有限公司提供，生产批号EI 20130503)。确诊EV71感染的病原学检测由杭州市儿童医院检验科人员完成。选择杭州市儿童医院儿外科同期住院的非神经系统疾病手术患儿作为对照组。
1.1.2 临床病例分组参照国家卫生部公开发布的《手足口病诊疗指南(2010年版)》[4]及《肠道病毒71型(EV71)感染重症病例临床救治专家共识(2011年版)》[5]诊断标准，将手足口病患儿分为EV71感染普通病例组和EV71感染重症病例组，其中EV71感染重症病例组又分为重型组和危重型组。①EV71感染普通病例组：24例，男13例，女11例，年龄(1.9±1.1)岁，平均病程8 d(7～10 d)；其中8例患儿有惊跳，2例患儿有肢体抖动，3例患儿有惊厥，3例患儿有呕吐。选择入院时疑为手足口病并发中枢神经系统损害，经脑脊液常规、生化检查无异常，脑电图以及影像学检查正常，排除了中枢神经系统损害的手足口病普通病例。②EV71感染重症病例组：46例，男30例，女16例，年龄(2.8±1.7)岁，平均病程12 d(6～15 d)。其中重型组31例，男21例，女10例，年龄(3.0±2.0)岁；31例中18例患儿有惊跳，16例患儿有肢体抖动，1例患儿有嗜睡，1例患儿有惊厥，16例患儿有呕吐。危重型组：15例，男9例，女6例，年龄(2.5±1.1)岁；其中11例患儿有惊跳，12例患儿有肢体抖动，11例患儿有嗜睡，1例患儿有惊厥，9例患儿有呕吐。所有EV71感染重症病例组患儿在入院时定为急性期；在住院10～14 d 后，根据患儿体温正常稳定，意识无障碍，无肢体抖动和惊厥，无呕吐等情况，定为恢复期。③对照组：21例，男11例，女10例，年龄(2.3±0.9)岁。各组患儿在入院时性别、年龄、病程对比，差异无统计学意义。
1.2 标本的采集与测定方法各组病例于入院24 h内抽取静脉血3～4 ml和脑脊液(Cerebro-Spinal Fuid，CSF) 2 ml(对照组于手术当日行腰麻时抽取CSF)。重症病例组(32例)患儿于10～14 d进行第2次静脉血和CSF采集，每一次相对应的静脉血和CSF标本的采集时间相差不超过1 d；将静脉血低温离心取上清液置于EP管中，将血清及CSF存于-70 ℃冰箱中待检。 如果有溶血标本，重新采集。采用双抗体夹心ELISA法检测血清及CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1的含量。检测试剂均购自美国eBioscience公司(sCD40 批号 85375020，sCD40L 批号 85064709，VCAM-1批号XY-1362)。EV71型IgM检测方法为捕获ELISA法，采用北京万泰生物药业股份有限公司生产的EV71-IgM快速检测试剂盒 ，操作由专业人员严格按药盒说明书进行。
1.3 统计学分析所有数据均采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。 计量资料以均数±标准差($\mathop x\limits^ -$±s)表示。 采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对多组数据进行统计学分析，组间两两比较采用 LSD 法进行；采用Spearman检验分析数据的相关性，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 重症病例组与普通病例组、对照组血清及CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1的含量比较重症病例组血清和CSF中sCD40、sCD40L含量均显著高于普通病例组和对照组，见表 1，差异有统计学意义(均P<0.01)；普通病例组血清和CSF中sCD40、sCD40L含量与对照组差异无统计学意义(均P>0.05)。重症病例组血清和CSF中VCAM-1水平显著高于普通病例组和对照组，差异有统计学意义(均P<0.01)；普通病例组血清和CSF中VCAM-1水平与对照组差异无统计学意义(均P>0.05)。
| 组别 | n | 血清 | 脑脊液 | ||||
| sCD40 | sCD40L | VCAM-1 | sCD40 | sCD40L | VCAM-1 | ||
| 注：(1)重症病例组与普通病例组比较(P<0.01，LSD 法)；(2)普通病例组与对照组比较(P>0.05，LSD 法)；(3)对照组与重症病例组比较(P<0.01，LSD 法)；(4)P<0.05为差异有统计学意义(单因素方差分析)。 | |||||||
| 重症病例组 | 46 | 141.90±60.81(1) | 6.58±2.91a(1) | 2055.68±348.64(1) | 40.03±6.81(1) | 0.86±0.08(1) | 185.24±34.94(1) |
| 普通病例组 | 24 | 101.79±39.81(2) | 4.39±2.40(2) | 1613.35±267.65(2) | 34.28±7.64(2) | 0.78±0.10(2) | 155.48±33.68(2) |
| 对照组 | 21 | 97.33±33.42(3) | 4.38±2.38(3) | 1591.06±273.51(3) | 32.72±6.44(3) | 0.76±0.08(3) | 156.38±28.93(3) |
| F值 | - | 8.083 | 7.864 | 24.394 | 10.471 | 13.734 | 9.061 |
| P值 | - | 0.001(4) | 0.001(4) | 0.000(4) | 0.000(4) | 0.000(4) | 0.000(4) |
重症病例危重型组血清sCD40、sCD40L含量和CSF中sCD40L含量均显著高于重症病例重型组，见表 2，差异有统计学意义(均P<0.05)，且CSF中sCD40含量亦显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；重症病例危重型组和重症病例重型组二组血清和CSF中sCD40、sCD40L含量均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。重症病例危重型组血清和CSF中VCAM-1水平均显著高于重症病例重型组，差异有统计学意义(均P<0.05)；重症病例危重型组和重症病例重型组二组血清和CSF中VCAM-1水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。
| 组别 | n | 血清 | 脑脊液 | ||||
| sCD40 | sCD40L | VCAM-1 | sCD40 | sCD40L | VCAM-1 | ||
| 注：(1)重型组与危重型组比较(P<0.05或P<0.01，LSD 法)；(2)危重型组与对照组比较(P<0.05或P<0.01，LSD 法)；(3)对照组与重型组比较(P<0.05或P<0.01，LSD 法)；(4)P<0.05为差异有统计学意义(单因素方差分析)。 | |||||||
| 重型组 | 31 | 129.04±50.35(1) | 5.94±2.68(1) | 1983.49±346.90(1) | 37.96±5.59(1) | 0.84±0.07(1) | 178.11±32.33(1) |
| 危重型组 | 15 | 166.09±72.32(2) | 7.78±3.02(2) | 2191.58±318.51(2) | 43.93±7.34(2) | 0.89±0.08(2) | 198.65±36.66(2) |
| 对照组 | 21 | 97.33±33.42(3) | 4.38±2.38(3) | 1591.06±273.51(3) | 32.72±6.44(3) | 0.76±0.08(3) | 156.38±28.93(3) |
| F值 | - | 8.064 | 7.536 | 17.870 | 14.877 | 16.526 | 8.025 |
| P值 | - | 0.001(4) | 0.001(4) | 0.000(4) | 0.000(4) | 0.000(4) | 0.001(4) |
重症病例组急性期血清和CSF中sCD40、sCD40L含量均显著高于恢复期和对照组，见表 3，差异有统计学意义(均P<0.01)，但恢复期血清和CSF中sCD40、sCD40L含量与对照组差异无统计学意义(均P>0.05)。重症病例组急性期血清和CSF中VCAM-1含量均显著高于恢复期和对照组，差异有统计学意义(均 P<0.01)，但恢复期血清和VCAM-1含量与对照组差异无统计学意义(均P>0.05)。
| 组别 | n | 血清 | 脑脊液 | ||||
| sCD40 | sCD40L | VCAM-1 | sCD40 | sCD40L | VCAM-1 | ||
| 注：(1)重症病例组急性期与重症病例组恢复期(P<0.01，LSD 法)；(2)重症病例组恢复期与对照组比较(P>0.05，LSD 法)；(3)对照组与重症病例组急性期(P<0.01，LSD 法)；(4)P<0.05为差异有统计学意义(单因素方差分析)。 | |||||||
| 重症病例组急性期 | 32 | 141.90±60.81(1) | 6.58±2.91(1) | 2055.68±348.64(1) | 40.03±6.81(1) | 0.86±0.08(1) | 185.24±34.94(1) |
| 重症病例组恢复期 | 32 | 91.87±36.01(2) | 4.43±2.32(2) | 1554.94±360.24(2) | 35.05±6.01(2) | 0.76±0.07(2) | 138.84±37.26(2) |
| 对照组 | 21 | 97.33±33.42(3) | 4.38±2.38(3) | 1591.06±273.51(3) | 32.72±6.44(3) | 0.76±0.08(3) | 156.38±28.93(3) |
| F值 | - | 15.035 | 10.059 | 29.672 | 12.227 | 24.503 | 21.770 |
| P值 | - | 0.000(4) | 0.000(4) | 0.000(4) | 0.000(4) | 0.000(4) | 0.000(4) |
所有病例血清与CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1均呈正相关，相关系数分别为r=0.458、r=0.360和r=0.586(均P<0.01)；重症病例组血清与CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1均呈正相关，相关系数分别为r=0.519、r=0.628和r=0.648(均P<0.01)；普通病例组、对照组血清与CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1均无相关性。
2.4.2 sCD40与sCD40L关系所有病例血清、CSF中sCD40与sCD40L呈正相关，相关系数分别为r=0.427和r=0.426(均P<0.01)；重症病例组血清、CSF中sCD40与sCD40L呈正相关，相关系数分别为r=0.526和r=0.560(均P<0.01)；普通病例组血清、CSF中sCD40与sCD40L无相关性；对照组血清、CSF中sCD40与sCD40L无相关性。
2.4.3 VCAM-1与sCD40关系所有病例血清、CSF中VCAM-1与sCD40呈正相关，相关系数分别为r=0.566和r=0.411(均P<0.01)；重症病例组血清、CSF中VCAM-1与sCD40呈正相关，相关系数分别为r=0.634和r=0.558(均P<0.01)；普通病例组血清、CSF中VCAM-1与sCD40无相关性；对照组血清中VCAM-1与sCD40呈正相关，相关系数为r=0.570(P<0.01)，对照组CSF中VCAM-1与sCD40无相关性。
2.4.4 VCAM-1gn sCD40L关系所有病例血清、CSF中VCAM-1与sCD40L呈正相关，相关系数分别为r=0.208和r=0.433(均P<0.01)；重症病例组血清、CSF中VCAM-1与sCD40L呈正相关，相关系数分别为r=0.368和r=0.433(均P<0.01)；普通病例组血清、CSF中VCAM-1与sCD40L无相关性；对照组血清中VCAM-1与sCD40L呈负相关，相关系数为r=-0.639(P<0.01)，对照组CSF中VCAM-1与sCD40L无相关性。
3 讨论血脑屏障是在脑实质与血液循环之间起隔离作用的重要屏障，而脑微血管内皮细胞构成血脑屏障的重要组成部分，病毒感染时血源性炎症细胞必须经过脑的血管内皮细胞系统后才能到达脑组织，脑血管内皮细胞系统在控制白细胞游走至脑组织、免疫反应发生、炎症调节中发挥重要作用。EV71脑炎与其他病毒性脑炎的病理变化相似，病变早期主要以脑血管周围为主，以后可出现局部或广泛的神经细胞坏死及胶质细胞增生等[6]。
CD40-CD40L系统是炎症过程中重要的信号通路，可调节多种炎症反应。可溶性CD40L(sCD40L)是由CD40L水解而成，存在于未被激活的血小板内部的CD40L在血小板激活后迅速表达于血小板表面，在几分钟或是几小时内被水解产生可溶性片段，即sCD40L[7]。CD40可表达于血管内皮细胞、平滑肌细胞表面，CD40L、sCD40L均可通过与血管内皮细胞、平滑肌细胞表达的CD40相互作用，进一步激活NF-κB及c-JunN-末端激酶的信号转导途径，进而诱导一系列炎性细胞因子的表达[8]。在对血管新生的炎症反应研究中，人们发现CD40/CD40L是一对很强的促血管形成系统。大脑感染HIV-1的细胞能分泌sCD40L，使脑血管内皮细胞CD40表达上调，二者相互作用后加剧脑内炎症反应。sCD40L通过作用于血脑屏障紧密连接复合物破坏血脑屏障的功能，CD40作为血脑屏障的调节器，与之共同参与促炎作用[2]。CD40/CD40L二聚体在神经炎症过程血脑屏障破坏中起重要作用。研究发现，单纯疱疹病毒脑炎时，小胶质细胞CD40表达增加，与浸润脑内的淋巴细胞上表达的CD40L作用后，小胶质细胞被激活，促进其抗原提呈作用和细胞因子的产生[9]；西尼罗病毒性脑炎时，CD40-CD40L相互作用有利于T淋巴细胞跨血脑屏障迁移，控制西尼罗病毒感染[10]。
血管内皮细胞损伤是病毒性脑炎发病的一个主要机制。研究表明，血中VCAM-l的水平可以作为血管内皮功能紊乱及内膜损伤情况指标。一般来说，非活化内皮细胞有低至正常的VCAM-1表达，当受到细胞因子(如IL-1、TNF-α、IL-13)和细胞外基质分子的诱导时VCAM-1表达增强[11]。VCAM-1通过与整合素家族的极晚期抗原-4(very late antigen-4，VLA-4)相互作用，使白细胞与内皮细胞牢固结合，促使激活的T淋巴细胞易于跨内皮细胞游走到炎性组织，发挥炎症性损伤作用[12]。脑缺血再灌注后VCAM-1表达增高，使白细胞与血管内皮细胞间的黏附增强；抗VCAM-1单克隆抗体可起到一定的缺血性脑保护作用[13]。
CD40/CD40L信号通路与中枢神经系统炎症和全身性炎症反应密切相关，CD40与CD40L相互作用后能上调共刺激分子(ICAM-1/VCAM-1/CD40)、Fas配体以及细胞因子(IL-1，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，TNF-α等)的表达。在体外实验中证实sCD40L能促进脑微血管内皮细胞黏附分子的表达，促进单核细胞的附着和迁移，参与神经系统炎症过程[14]。
本研究表明重症病例组血清和CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1含量均显著高于普通病例组和对照组，而普通病例组血清和CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1含量与对照组差异无统计学意义，提示血清和CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1可能在EV71脑炎的发病中起重要作用。重症病例危重型组血清和CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1含量均显著高于重症病例重型组，但二组血清和CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1含量均高于对照组，提示血清和CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1含量可反映EV71感染后病情的严重程度，有助于判断EV71脑炎中枢神经系统受累程度；重症病例组急性期血清和CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1含量均显著高于恢复期和对照组，但恢复期血清和CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1含量与对照组差异无统计学意义，提示血清和CSF中sCD40、sCD40L和VCAM-1含量对EV71脑炎的预后判断有一定价值。相关分析结果为重症病例组血清和CSF中三指标(sCD40、sCD40L和VCAM-1)间均呈正相关，表明sCD40、sCD40L和VCAM-1共同参与了EV71脑炎的发病过程。但它们是如何参与EV71脑炎的发病的？是否在炎症时，CD40和CD40L二者相互作用，调节VCAM-1等的表达，以及可诱导多种类型细胞(如单核细胞、平滑肌细胞及上皮细胞)表达一些前炎症因子(如IL-1、IFN-γ、TNF-α等)参与到炎症反应中来，有待于今后进一步的研究。
| [1] | Luo XH, Zhang YM, Zhang JQ, et al. Etiology and genotype of pathogens causing 4 hand foot and mouth disease outbreaks [J]. China Preventive Medicine,2008,12:1041-1043. (in Chinese) 罗学辉,张怡明,张建群,等. 4起手足口并疫情病原检测与基因特征分析[J]. 中国预防医学杂志,2008,12:1041-1043. |
| [2] | Ramirez SH, Fan SS, Dykstra H, et al. Dyad of CD40 CD40 ligand fosters neuroinflammation at the blood brain barrier and is regulated via JNK signaling: Implications for HIV-1 encephalitis [J]. J Neurosci,2010,30(28):9454-9464. |
| [3] | Viallard JF, Solanilla A, Gauthier B, et al. Increased soluble and platelet-associated CD40 ligand in essential thrombocythemia and reactive thrombocytosis [J]. Blood,2002,99(7):2612-2614. |
| [4] | The Ministry of Health of the People's Republic of China. Guideline for hand foot and mouth disease diagnosis and treatment (2010 version) [J]. International Journal of Respiration,2010,30(24):1473-1475. (in Chinese) 中华人民共和国卫生部. 手足口病诊疗指南(2010年版)[J]. 国际呼吸杂志,2010,30(24):1473-1475. |
| [5] | Clinical expert group of HFMD, the Ministry of Health. Consensus of clinical experts in severe EV71 infection diagnosis and treatment (2011 version) [J]. Chinese Journal of Pediatrics,2011,49(9):675-678. (in Chinese) 卫生部手足口病临床专家组.肠道病毒71型(EV71)感染重症病例临床救治专家共识(2011年版)[J].中华儿科杂志,2011,49(9):675-678. |
| [6] | Liu YX, Zhou BP. Progress in research of EV71 related HFMD [J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Infectious Diseases: Electronic version,2010,4(1):71-75. (in Chinese) 刘映霞,周伯平. 肠道病毒71相关性手足口病新进展[电子版]. 中华实验和临床感染病杂志,2010,4(1):71-75. |
| [7] | Kawabe T, Matsushima M, Hashimoto N, et al. CD40 /CD40 ligand interactions in immune responses and pulmonary immunity[J]. Nagoya J Med Sci,2011,73(3/4):69-78. |
| [8] | Schonbeck U, Libby P. The CD40/CD154 receptor/ligand dyad[J]. Cell Mol Life Sci,2001,58(1):4-43. |
| [9] | Zhou Y, Zhang M, Mei YW. Role of CD40 molecule-CD40L molecule in pathogenesis of herpes simplex virus caused encephalitis [J]. Journal of Clinical Emergency,2006,7(6):317-319. (in Chinese) 周瑜,张敏,梅元武. CD40分子-CD40L分子在单纯疱疹病毒性脑炎发病机理中的作用[J]. 临床急诊杂志,2006,7(6):317-319. |
| [10] | Sitati E, McCandless EE, Klein RS, et al. CD40-CD40 ligand interactions promote trafficking of CD+8 T cells into the brain and protection against West Nile virus encephalitis[J]. J Virol,2007,81(18):9801-9811. |
| [11] | Wang L, Shirure VS, Burdick MM, et al. UVB-irradiation regulates VLA-4-mediated melanoma cell adhesion to endothelial VCAM-1 under flow conditions [J]. Mol Carcinog,2011,50(1):58-65. |
| [12] | Ohtani K, Egashira K, Hiasa KI, et al. Blockage of vascular endothelial growth factor suppresses experimental restenosis after intraluminal injury by inhibiting recruitment of monocyte lineage cells[J]. Circulation,2004,110(16):2444-2452. |
| [13] | Zhang LL, Wang JZ, Zhou HD, et al. VCAM-1 expression and change of adhesiveness after reperfusion in rats with cerebral ischemia [J]. Chinese Journal of Clinical Neurosciences, 2002,10(4):329-331,334. (in Chinese) 张莉莉,王景周,周华东,等. 大鼠脑缺血再灌注后VCAM-1的表达与黏附性变化[J]. 中国临床神经科学,2002,10(4):329-331,334. |
| [14] | Singh MV, Davidson DC, Jackson JW, et al. Characterization of platelet-monocyte complexes in HIV-1-infected individuals: possible role in HIV-associated neuroinflammation[J]. J Immunol,2014,192(10):4674-4684. |