比较基因组学已发现结核分枝杆菌中的有些基因区在牛分枝杆菌及卡介苗中缺失，也就是RDI区 和RD2区^[1]。RD1区(Rv3871~Rv3879c)是在BCG菌株中缺失的区域^[2]。因而该区编码的蛋白在研究结核分枝杆菌的毒力及致病方面有重要作用。RD1区编码的蛋白因其不与BCG有交叉反应可用于结核分枝杆菌的T细胞反应检测。在这些抗原中，ESAT6 (ESXA，Rv3875)，CFP10 (ESXB，Rv3874)，PPE 68 (Rv3873)及 PE 35 (Rv3872)是与机体免疫反应相关的^{[3, 4, 5]}。以往对ESAT6和CFP10已有较为详细的研究，它们是结核分枝杆菌的主要毒力因子^{[6, 7]}及结核病诊断的重要候选抗原^[8]。PE 35和PPE 68属于PE/PPE蛋白家族并与机体的免疫反应相关。PE/PPE蛋白由结核分枝杆菌细胞壁分泌或者与其相关，并调节宿主-病原相互作用^{[9, 10, 11]}，而 PE 35和 PPE 68与结核感染后的细胞免疫反应有关。

有研究表明结核分枝杆菌PE/PPE基因有高度序列变异^{[12, 13]}，进一步提示其可能参与抗原变异。为了更好地阐述RD1区PE-PPE基因家族PE 35和PPE 68基因的多态性，及基因突变对免疫识别的影响，我们从中国选取了161 株临床分离株；进行基因扩增，然后序列比对。分析其在T细胞抗原表位的多态性及有可能产生的功能改变。

实验用的161 株菌株从中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所结核室保存的2346株国内结核分枝杆菌复合群临床分离株中挑选，考虑到北京家族菌株在中国的优势性，研究挑选了北京家族菌株82 株和非北京家族菌株79 株，82 株北京家族菌株从1738 株的北京家族菌株中随机挑选，79 株非北京家族菌株从608 株非北京家族菌株中挑选，同时尽可能包括不同省份不同Spoligtyping 类型的菌株。这些菌株囊括了所有已经在我国发现的Spoligtyping 类型。161 株菌株的省份来源及Spoligtyping分型数据见表 1、2。

采用标准的罗氏培养基培养菌株3~4 周。用生理盐水从培养基的斜面上洗脱菌体，80 ℃孵育30 min灭活，离心收集菌体，用400 μl TE悬菌，于沸水中煮沸30 min，12 000 r/min 离心4 min，取上清即为DNA模板，-20 ℃保存备用。

引物是由DNAStar 软件根据H37Rv 标准菌株的基因序列设计获得：PE 35：5′-GTA ATC GAG TTC GGG CAA TG-3′，5′-AGG CTT CTC CCA GAG AGT T-3′; PPE 68：5′-GAC ATT GGC ACG CAA GTG AG-3′，5′-TAG CGG CAT CGG TCT TCA TC-3′。

PCR反应体系为：模板DNA(500 pg)1 μl，10×PCR buffer 10 μl，引物 100 nmol/L，dNTP 混合液 200 μmol/L，DNA Taq 酶(TaKaRa) 0.5 U，ddH₂O 加至20 μl。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃终延伸10 min。

阳性对照使用结核H37Rv菌株的500 pg DNA。阴性对照为不加模板DNA，只有PCR试剂。PCR产物的有无及大小用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。所有的聚合酶链反应(PCR)实验都至少进行2次以确认实验的重复性。扩增产物由北京擎科生物技术有限公司进行双向测序和拼接。

检索免疫表位数据库(Immune Epitope Database，IEDB)，获得结核分枝杆菌中存在的T细胞抗原表位序列，再与H37Rv株的PE 35和PPE 68基因序列进行比对，最终获得在该基因中存在的人T细胞抗原表位信息，见表 3。

PCR产物的序列由ABI 3730xl DNA分析软件分析。序列连接用的是ClustalW软件^[14]。序列比对和翻译使用Bioedit 7.2.3软件。SPSS 14.0 软件用于χ²分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

经扩增PE 35和PPE 68基因序列及序列比对，所有的161 株菌株均获得相应的PCR产物。在这161 株菌株中，23 株显示有PE 35基因多态性，见图 1，8 株菌有PPE 68基因多态性。对于PE 35，21 株菌有A碱基缺失，另外2 株有非同义突变。而PPE 68，2 株有2种不同的缺失，6 株显示有5种非同义突变，见图 1、2。

图 1 161株菌株PE 35抗原的序列比对结果 Fig. 1 Sequence alignment of PE 35 gene of 161 M. tuberculosis strains 注：23 株有基因水平的改变；另外138 株与H37Rv菌株相同。T细胞抗原表位区域在H37Rv中标出。阴影部分表示氨基酸改变的位置。

图选项

图 2 161株菌株PPE 68抗原的序列比对 Fig. 2 Sequence alignment of PPE 68 gene of 161 M. tuberculosis strains 注：8 株菌在基因水平有改变，另外153 株与标准株H37Rv相同，阴影部分表示氨基酸改变的位置。

图选项

表 2和表 4显示了PE 35和PPE 68 AA碱基的改变及位置。所有改变均导致氨基酸的改变。PE 35基因中有21 株菌株A碱基的缺失引起移码突变，进而导致蛋白翻译的提前终止，必然会影响蛋白功能。PPE 68基因中，菌株HeN06041 5 bp的缺失也导致了蛋白翻译的提前，可能对蛋白的功能有明显的影响。菌株HuN06004 18 bp的缺失引起PPE 68蛋白6个氨基酸的缺失。

对于PE 35基因，23 株突变菌株包括4 株北京家族，13 株U家族，3 株T家族，1 株MANU家族和2 株新型家族。2 株非同义突变的菌株均是北京家族。对于PPE 68，8 株突变菌株包括2 株北京家族菌株，2 株T家族菌株，2 株EAI家族菌株，1株U家族菌株和1 株 MANU家族菌株。2株EAI家族菌株，FJ06051和 FJ05406在PPE 68基因229(V-L)氨基酸位置都有相同的突变，这很有可能代表EAI家族一种特殊的突变。菌株HuN06004在PE 35和PPE 68基因均有呈现出基因多态性。

非北京家族PE 35基因的突变率明显高于北京家族(表 4，P<0.05)，而PPE 68基因突变虽是非北京家族高于北京家族，但差异无统计学意义。

根据免疫细胞表位数据库(IEDB)^[15]，PE 35和PPE 68共有63个人类T细胞表位。表 4显示了这两种抗原的T细胞表位的改变。在PE 35基因中，除了菌株JL06018的突变外的其余突变都导致其T细胞抗原表位的改变。在PPE 68基因，62个T细胞抗原表位覆盖了所有的基因序列，没有非T细胞抗原表位区，这也提示PPE 68对于T细胞感染免疫反应的重要性。PPE 68基因中，62个T细胞表位中有58个(占93.5%)发生了改变。

菌株HeN06041 5 bp的缺失引起了PPE 68蛋白编码位置的移码突变，这导致相应的T细胞表位的改变，包括IEDB_ID 191，65054，68284，68285及其下游的表位。菌株HuN06004 18 bp的缺失导致6个氨基酸的缺失，引起表位IEDB_ID21179的改变。

本研究根据地区和基因型分布等，随机从国内不同地区来源，不同Spoligtyping基因型的2346 株临床分离的结核分枝杆菌复合群菌株中，选取了161 株，采用PCR和DNA测序的方法，对PE 35和PPE 68基因及其T细胞抗原表位进行了分析。菌株代表性好，得出的结果有较高的可信度。

基因组学及生物信息学分析表明RD 1区编码的蛋白是参与分泌ESAT 6和CFP 10分泌系统的一部分，即EAST-6分泌系统(ESX-1)。PE 35，CFP 10及ESAT 6是刺激人类外周血单核淋巴细胞参与保护性Th 1细胞反应检测的重要抗原，也就是刺激增殖并产生γ-干扰素的抗原^[4]。PPE 68是主要的细胞壁相关抗原^[16]，并与RD 1区的蛋白Rv 3866，Rv 3868，CFP10，ESAT-6形成免疫复合物^{[17, 18]} 。最近研究表明PE 35及PPE 68在RD 1-相关的发病机制中发挥重要作用，可能促成及维持M.tb的感染^[19]。在161 株菌种，有14.3%的菌株在PE 35基因中有一A碱基的缺失导致蛋白编码的提前终止，从全长99氨基酸缩短为16个氨基酸。此改变可能会完全改变蛋白结构，同时可引起PE 35功能的缺失。菌株HeN 06041 PPE 68蛋白5 bp的缺失同样引起蛋白编码提前终止，这一改变也有可能对蛋白功能有明显的影响。考虑到PE 35和PPE 68与结核分枝杆菌的毒力和免疫相关，PE 35和PPE 68蛋白的突变菌株很有可能会引起菌株毒力的改变。此外，因PE 35对EsxA/B分泌系统及RD 1的毒力是必需的，PE 35的无效突变(即蛋白编码提前终止的菌株)有可能会影响ESX-1抗原的分泌(CFP 10，ESAT 6)^[20]。而PPE 68对 ESX-1抗原的分泌具有调节作用^[20]，因此我们推测PPE 68的突变可能会影响ESAT 6，CFP 10的分泌。下一步工作需进一步研究PPE 68和PE 35蛋白的突变菌株与野生菌株抗原毒力的差异。

PE/PPE基因具是多变的，并编码细胞表面蛋白，该基因可能参与了抗原变异并被认为是逃避宿主免疫的主要因子^[21]。2010年，Comas等^[22]研究报道结核分枝杆菌人类T细胞抗原表位的进化是高度保守的，因此推测其缺少抗原变异及免疫逃逸。但因由于一些技术原因，该研究没有包括PE/PPE基因。在本研究中，根据免疫表位数据库(IEDB)，在PE 35和PPE 68中共有63个人类T细胞表位^[15]。在所有的菌株中，63个T细胞抗原表位中有59个(占 93.7%)发生了改变，这些T细胞抗原表位大量氨基酸的改变可能反映出正在进行的免疫逃逸。本研究的实验数据说明一些PE/PPE家族蛋白基因有高度的序列变异，这有可能引起相关抗原的改变，进而导致免疫逃逸。

PE 35的基因突变在非北京家族中明显高于北京家族，这意味着北京家族菌株比非北京家族菌株更为保守，非北京家族更有可能应对宿主的免疫压力而产生抗原变异。这与之前的研究结果一致，即北京家族菌株相对于其他的结核分枝杆菌菌株基因更为保守，比其他型别的结核分枝杆菌有选择优势^[23]。有证据显示T细胞的识别可能会直接促成人与人之间结核分枝杆菌复合群的传播^[24]。本研究结果提示北京家族可能比非北京家族更容易被宿主T细胞识别，进而更容易传播。

据报道PE 35有可能作为血清学诊断的抗原^[25]。本研究发现PE 35具有相当多的氨基酸改变，因此在选用PE 35作为血清学诊断候选抗原时应充分考虑到菌株突变的影响。