青海湖位于我国西北部的青藏高原，是我国最大的内陆咸水湖，也是候鸟繁殖和越冬季节的自然栖息地。目前公认的8条候鸟迁徙路线中有3条途经青海省，包括中亚迁徙路线，东亚-澳大利亚迁徙路线和东非-西亚迁徙路线。2005年5月青海湖暴发野鸟禽流感疫情，高致病性H5N1禽流感病毒导致了6000多只野鸟死亡^{[1, 2]}。有证据表明这种病毒通过候鸟传播到了欧洲和非洲的某些地区。20062007年在青海湖地区依然可以监测到野鸟蛋中存在禽流感H5N1卵黄囊IgY 抗体，约占被检鸟蛋的30%，说明野鸟仍然存在该病毒的感染并且可能通过垂直传播给子代幼鸟^[3]。

为了系统研究青海湖周边地区禽流感病毒感染状况，笔者于2013年19月开展了连续监测。青海湖自然保护区根据生态保护方式的不同，可以分为核心区、缓冲区和外围区。核心区对人员、家禽和牲畜实行严格的限制，保障了核心区只有野生的禽鸟和动物活动。缓冲区是指环绕核心区的周围地区，外围区位于缓冲区周围。本研究选择了鸟岛、沙岛和仙女湾作为核心区采样地。外围和缓冲区选择在西宁市活禽市场、乐都县活禽市场、乐都县散养户和海晏县养殖场。

根据青海湖候鸟迁徙规律，每年4月去南方越冬的候鸟陆续返回青海湖产卵繁殖后代，大概在89月离开。因此本研究的野鸟相关环境标本采集时间为49月，而其他采样地的采集时间为19月。标本类型包括禽类粪便，被禽类及其粪便沾染的水和环境物体表面。标本采集液配方参考世界卫生组织(WHO)发布的《WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance 2006》，采样前1~2天配制采样液冷链运输到现场，用无菌拭子挑取5 g左右新鲜的粪便用无菌吸管吸取10 ml水样加到采样管里，用棉拭子蘸取采样液擦拭环境物体表面，保障低温的情况下运输到省疾病预防控制中心实验室。管离心(3000 r/min，15 min)，上清分装保存，并且编号记录。冷链环境下运输至国家流感中心后-70 ℃低温保藏。

将环境标本放置在室温下自然融化，加入联合抗生素，室温作用3~4 h。将处理好的标本，接种9~10日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚接种200 μl标本液。放置37 ℃恒温培养箱培养 48 h。然后放置在4 ℃过夜，第2天收获鸡胚尿囊液。用红细胞凝集实验测定病毒的血凝滴度。

对病毒分离血凝阳性的标本使用QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit提纯病毒核酸，采用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法进行核酸检测，引物和探针为WHO公布的针对甲型流感病毒M基因的通用引物和探针。将Ct值≤30的定义为阳性，将Ct值≥33的定义为阴性，将Ct值介于30和33之间的重复检测一次，如果仍然在两数值之间，再用一步法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证，PCR反应产物进行凝胶电泳检测，有特异条带为阳性，否则为阴性。对于上述甲型流感检测方法阳性的标本，再使用流感病毒亚型特异性引物，采用一步法RT-PCR进行H5、H7和H9以及N1、N2亚型鉴定。

将H5亚型流感病毒的血 凝素基因同样采用一步法RT-PCR进行分段扩增，因扩增引物两端含有M13的正反序列方便进行下一步的测序反应。序列测定采用ABI公司的BigDye 3.1试剂盒，3730 XL序列分析仪。将HA基因片段的序列放入DNAStar 7.1软件SeqMan程序进行序列拼接。将H5亚型病毒的血凝素蛋白HA1和HA2链接肽部位的氨基酸序列推导出来，比较是否具有高致病性禽流感病毒的特点。

应用SPSS软件，根据条件选择Fisher精确检验法比较不同时间和不同分离地点间的甲型流感病毒分离率的差异。

2013年19月间在青海湖地区的7个监测点共采集环境样本6364份，其中野鸟相关环境标本2420份，来自于鸟岛、沙岛和仙女湾；采集家禽相关环境标本3944份，来自西宁市活禽市场、乐都县活禽市场、乐都县散养户和海晏县养殖场。野鸟相关环境标本病毒分离阴性。家禽共分离到49 株病毒，阳性率为0.77%。不同采样点病毒分离率分别为2.02%(33/1636)、3.06%(14/457)、0(0/1083)和0.26%(2/768)，其中乐都县活禽市场最高，活禽市场同其他2种采样地(养殖场和散养户)间差异有统计学意义(χ²=45.6，P<0.05)。但西宁市活禽市场和乐都县活禽市场间差异无统计学意义。

上述分离的49 株甲型流感病毒，在19月中每月分离到的病毒数占总病毒数量的构成比分别为30.61%、20.41%、14.29%、0、4.08%、2.04%、6.12%、2.04%和20.41%。不同月份甲型流感病毒分离率不同，最高3.25%(15/465)。不同月份样本甲型禽流感病毒阳性率差异有统计学意义，13和9月高于其他5个月(χ²=30.2，P<0.05)，但是这4个月间差异无统计学意义，见图 1。

图 1 不同月份家禽环境标本流感病毒分离率 Figure. 1 Monthly influenza virus isolation rates of poultry samples

图选项

在6364份青海湖周边地区环境标本中共分离到111份红细胞凝集阳性的分离物。其中49份经检测为甲型流感病毒阳性。其余62份排除了甲型流感病毒的分离物没有做进一步检测，可能是新城疫病毒感染或者其他可以引起红细胞凝集的禽类病毒或者细菌感染。根据检测流程，将甲型流感阳性的标本进行H5、H7和H9亚型检测。检测到H5亚型、H9亚型、H5和H9亚型混合毒株，未检测到H7亚型病毒。对血凝素亚型(HA)阳性的标本进行神经氨酸酶(NA)亚型鉴定，采用一步法RT-PCR的方法。结果为H5N1亚型流感19 株，H9N2亚型流感27 株，H5N1和H9N2混合病毒3 株，见表 1。

为进一步研究青海湖地 地区H5N1禽流感病毒的致病性，笔者将所有H5N1阳性的病毒HA基因进行了序列测定，并将HA1和HA2链接肽部分的氨基酸组成进行了推导，发现全部H5N1病毒在链接肽的部位均具有多个碱性氨基酸(REKRRKR↓G)的基本序列，符合高致病性禽流感病毒的分子特征。

青海省地处国际间候鸟迁徙路线上的重要位置，全球8条线路中有3条在青海省交汇^[4]。20032009年间青藏高原野鸟中共有9起禽流感暴发，其中3起发生在青海湖及其周边地区^{[5, 6]}。3次禽流感野鸟中发生的疫情均没有向家禽和人间扩散。自2010年以来该地区野鸟中没有发现高致病性禽流感导致的鸟类大量死亡，但是禽流感在野鸟和家禽中的生态分布是本研究的需要。青海湖地区的野鸟大部分为夏候鸟，即夏季在青海湖地区栖息和繁殖，秋冬季节开始迁徙去南部过冬。9月正是候鸟迁徙的季节。有文献报道在秋冬季节候鸟开始迁徙时会出现禽流感流行的高峰^[7]。本研究在2013年49月期间采取每月1次的横断面研究，希望通过系统采集野鸟和家禽环境样本了解禽流感在该地区的分布情况。

本研究中共采集了2420份野鸟环境标本，但病毒分离结果是阴性。可能由于野鸟中禽流感的带病毒率本身就很低，加之禽流感病毒在环境中存活的时间受诸多因素影响所致。另外，禽流感病毒的分布还与气候变化、野禽种类等因素有关。因此，野鸟相关环境标本的监测是需要收集长期和大量样本来完成的。

禽流感根据血凝素蛋白链接肽部位碱性氨基酸的多寡可以分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。目前发现的有高致病性特征的禽流感病毒均存在于H5和H7亚型^[8]。研究监测过程中在活禽市场和家禽养殖户均分离到H5N1亚型的高致病性禽流感且集中在2014年13月，提示该亚型病毒在此期间有过小的流行，并且在流行病学调查中，发现活禽市场有大量病死禽的现象，也证实了这一点。青海湖地区地广人稀，养殖场和散养户间的距离相隔很远，降低了家禽间相互传播禽流感的风险。但是活禽市场的活禽交易频繁，携带了禽流感病毒的禽类与健康家禽在同一活禽市场环境中，增加了病毒传播和产生重配病毒的机会。这也是乐都和西宁两地的活禽市场检测到病毒阳性率高的原因。

通过对青海湖周边地区禽流感的监测，了解该地区的禽流感流行和分布情况，可以掌握高致病性禽流感在家禽和野鸟中的存在和进化趋势，为流感大流行预警、准备和应对提供科学依据。