禽流感(Avian influenza)是甲型流感病毒在多种家禽、野禽和鸟类之间传染的禽类传染病。禽流感病毒按照致病性强弱，可分为高致病性、低致病性和非致病性三类，目前引起人类感染和发病的禽流感病毒主要为H5、H7及H9亚型，人感染禽流感主要是由于接触感染病毒的禽鸟及其分泌物和排泄物^[1]。为了解丽水市外环境及禽鸟H5、H7及H9亚型禽流感病毒的动态分布状况，为人感染禽流感预防控制工作提供依据，本研究选择该市部分城乡活禽交易市场、家禽规模养殖场(户)、家禽宰杀加工场所、家禽散养户集中的地区、野生禽鸟栖息地等场所作为监测点，采集这些禽类所在场所外环境中的家禽粪便、笼具表面涂抹物、禽类饮水、清洗禽类的污水、宰杀或摆放禽肉案板表面的涂抹物等标本，开展H5、H7及H9亚型禽流感病毒监测。现将监测结果报告如下。

20092012年选择缙云县，2013年增加青田县、松阳县，2014年后扩大到丽水全市9县(市、区)。按单纯随机抽样方法选择部分城乡活禽交易市场、家禽规模养殖场(户)、家禽宰杀加工场所、家禽散养户集中的地区、野生禽鸟栖息地等场所作为外环境监测点，具体为20092012年，在缙云县选择2家城乡活禽交易市场作为监测点，采集家禽粪便、笼具表面涂抹物、禽类饮水、清洗禽类的污水标本，每季度5~10份，2013年增加青田县和松阳县，各选择1家活禽交易市场采集上述标本，每季度5~10份，2014年开始扩大到全市所有县(市、区)，选择13家活禽交易市场作为监测点，按月采集5~10份上述标本。2014年在缙云县等6个县(市、区)选择10个禽类宰杀加工场所作为监测点，采集家禽粪便、笼具表面涂抹物、禽类饮水、清洗禽类的污水、宰杀或摆放禽肉案板表面的涂抹物标本，每季度不少于20份；选择34家家禽规模养殖场(户)作为监测点，采集家禽粪便标本、笼具表面涂抹物、禽类饮水标本，每季度不少于50份；选择22个家禽散养户集中的地区作为监测点，采集家禽粪便、笼具表面涂抹物标本，每季度不少于20份；选择5个野生禽鸟栖息地作为监测点，采集禽鸟粪便、不明原因死亡野禽咽拭子和肛拭子标本，每季度不少于10份；选择3个其他场所采集禽类粪便、不明原因死亡禽类咽拭子和肛拭子标本，每季度不少于15份。

按国家卫生和计划生育委员会《人感染禽流感疫情防控方案》的要求进行标本的采集、保存和运输。采样使用病毒采样运输管(北京友康)，主要采集家禽粪便标本、笼具表面涂抹物、禽类饮水、清洗禽类的污水、宰杀或摆放禽肉案板表面的涂抹物及其他标本(包括不明原因死亡家禽、野禽咽拭子和肛拭子)；标本在4 ℃条件下24 h内送至实验室，未能按时送达的置于-70 ℃以下保存。

从环境标本中提取病毒RNA后，采用实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction，real-time PCR)方法进行甲型流感病毒M基因核酸序列检测，核酸阳性的标本进一步检测 H5、H7、 H9 及H7N9亚型核酸。RNA提取：MagNA Prue Total Nucleic Acid Kit试剂盒(Roche)。Real-time PCR仪为美国ABI 7500。

甲型流感病毒和禽流感病毒H7N9核酸测定试剂盒由中山达安基因生产，禽流感病毒 H5、 H7、 H9 亚型核酸测定试剂盒由上海之江生产。PCR反应体系：总体积25.0 μl，包括real-time PCR反应检测混合液19.0 μl、引物混合液1.0 μl、RNA模板5.0 μl；参数设置：45 ℃ 10 min；95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，循环40次，在60 ℃单点荧光检测，选择FAM荧光通道，实验结果根据real-time PCR扩增曲线、Ct值判断。

禽流感病毒H5、H7、H9亚型核酸引物探针由国家流感中心下发。real-time PCR反应：One Step PrimeScript RT-PCR Kit PerFect Real-time试剂盒(TaKaRa)；PCR 反应体系：2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μl；引物Forward(40 μmol/L) 0.5 μl；引物Reverse(40 μmol/L) 0.5 μl；探针Probe (10 μmol/L) 0.5 μl；PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μl；TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μl；模板RNA 8.0 μl；DEPC水补足至总体积25.0 μl。反应参数：42 ℃ 30 min反转录，95 ℃预变性2 min，以95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s扩增45个循环，在55 ℃后进行单点荧光检测。实验结果根据real-time PCR扩增曲线、Ct值判断。

将有关数据录入 Excel 2003 软件进行整理，通过 SPSS 13.0 软件进行统计分析，率的比较采用χ²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

20092015年1月共监测1714份外环境标本，检出病毒核酸阳性标本332份，阳性率19.37%，监测到了H5、H7、H9和其他未分型禽流感病毒。各年度的阳性率差别较大，其中最高的为2015年1月的60.00%，其次为2014年的23.38%，2012年和2013年则未监测到阳性标本。从2014年开始监测到的H7均为H7N9亚型，见表 1。

丽水市外环境标本禽流感病毒检出率不同季度在15.61%～24.60%之间波动，以四季度检出最高，其中H5、H7、H9和其他未分型禽流感病毒在不同季度的检出率依次在 0～4.46%、0.29%～11.76%、1.88%～8.47%和4.71%～13.74%之间波动。H5亚型的检出率以三季度为高，一季度未检出；H7亚型的检出率一、四季度较高，二、三季度较低；H9亚型检出率一季度最低，四季度最高，其他未分型检出率四季度最高，一季度最低，见表 2。总体上H5的检出率最低。

9个县(市、区)阳性检出率在10.61%～70.00%之间，最高的为莲都区，阳性率为70.00%，最低的为青田和松阳县，分别为10.61%和10.91%。截至2015年1月，全市已有2/3的县监测到H7N9亚型，见表 3。

共监测各类外环境场所87个，检出禽流感病毒场所28个，占32.18%，以家禽宰杀加工场所和城乡活禽交易市场的检出病毒比例最高，分别为100%和92.3%。具体为：13个城乡活禽交易市场检出病毒12个，占92.31%；10家禽宰杀加工场所全部检出病毒；34家家禽规模养殖场(户)检出病毒3个，占8.82%；22个家禽散养户集中地区检出病毒1个，占4.54%；5个野生候鸟栖息地检出病毒1个，占20.00%；3个其他场所检出病毒1个，占33.33%。

检测上述6类场所1714份标本，检出禽流感病毒阳性标本332份，其中H5 亚型10份，H7亚型 62份，H9亚型 85份，同时检出H7和H9 亚型8份，H5和H9亚型 7份，其他未分型160份。H5、H7、H9及其他未分型的检出率分别为0.99%、4.08%、5.83%和9.33%。

不同场所来源标本病毒阳性率以家禽宰杀加工场所最高，达46.34%，其次为城乡活禽市场的23.54%，最低为家禽散养户集中地区，为1.25%，其差异具有统计学意义(χ²=112.87，P<0.05)。城乡活禽市场和家禽宰杀加工场所均监测到了H5、H7、H9亚型和其他未分型禽流感病毒，见表 4。

从不同类型的标本中均检出禽流感病毒核酸，最高为清洗禽类污水(40.00%)，最低为笼具表面涂抹物(12.07%)，不同种类标本阳性检出率差异具有统计学意义(χ²=76.5，P<0.05)。H5亚型检出率最高为清洗禽类污水(4.24%)，其他类标本未检出，平均检出率为0.99%；H7亚型检出率最高为清洗禽类污水(7.27%)，最低为笼具表面涂抹物(2.46%)，平均检出率为 4.08%；H9亚型检出率最高为清洗禽类污水(12.12%)，最低为笼具表面涂抹物(3.20%)，平均检出率为5.83%；其他未分型检出最高为清洗禽类污水(19.39%)，最低为其他类标本(5.77%)，平均检出率为9.33%。此外，在禽类粪便、清洗禽类污水、宰杀或摆放禽肉案板表面涂抹物各2份、1份禽类饮水同时检出H5和H9亚型，禽类粪便和清洗禽类污水各3份、笼具表面涂抹物、禽类饮水各1份同时检测到H7和H9亚型，见表 5。

甲型流感由于其基因片段可进行重组，可发生抗原漂移和抗原转换。近年来，禽流感病毒跨越种间屏障，由H5、H7、H9亚型禽流感病毒感染人的事件均有报道^{[2, 3, 4, 5, 6]}，特别是2013年，国内发生了新型H7N9禽流感的流行^{[7, 8]}，对公众健康造成了严重威胁。丽水市从2009年开始进行外环境禽流感病毒的监测工作，收集全市禽流感病毒相关信息与资料，了解其动态变化趋势，对研究禽流感病毒的来源和传播途径等环节十分必要。

real-time PCR检测技术是目前检测禽流感病毒的主要方法之一，由于是直接检测禽流感病毒核酸，具有灵敏度高、特异性强、快速等优点^{[9, 10, 11, 12]}，但该方法的实验结果易受多种因素的干扰，对实验过程的控制和技术要求比较高，同时需要实时荧光定量PCR仪用于定量检测，或PCR基因扩增仪用于定性检测，以及依据禽流感病毒的核酸特定序列研制的基于引物和探针的PCR检测试剂盒。通过丽水市疾病预防控制中心(CDC)的培训和指导，从2013年开始，丽水市下辖各县级CDC实验室均已开始运用该检测方法检测禽流感病毒核酸，为全市的禽流感病毒监测工作提供了实验室检测技术支持。

监测结果显示，该市多个县(市、区)外环境中存在对人类可感染致病的H5、H7、H9亚型禽流感病毒。从时间上看，截至2013年底监测到的主要为H5和H9及其他亚型禽流感病毒，未发现H7亚型禽流感病毒，从2014年1月首先在缙云县农贸市场的活禽宰杀点监测到了H7N9禽流感病毒，并发生了首例人感染H7N9禽流感病例，系宰杀携带病毒而外表健康的土鸡感染发病^[13]，随后，其他县(市、区)陆续监测到该病毒。从季节上看，不同亚型禽流感病毒的检出率有差别，H5亚型的检出率以三季度为高，一季度未检出；H7亚型的检出率一、四季度较高，二、三季度较低；H9亚型检出率一季度最低，四季度最高，其他未分型检出率四季度最高，一季度最低。总体上H5的检出率最低。季度分布结果表明一年四季禽流感病毒均可污染外环境，总体上以冬春季较为严重。各县(市、区)监测到的禽流感病毒型别和数量存在差异，则可能与各地监测点设置、采样时间、采集标本类别与数量有关，可能会引起结果误差，需要进一步加强和规范监测工作。

从监测结果来看，该市外环境禽流感病毒污染率高的场所主要为家禽宰杀加工场所、活禽交易市场，与相关报道类似^[14]。外环境标本检出率由高到低依次为清洗禽类的污水、宰杀或摆放禽肉案板表面涂抹物、禽类饮用水、禽类粪便、其他标本和笼具表面涂抹物，表明在禽类销售、宰杀等环节中极易造成环境污染，尤其是宰杀环节中所用的水和案板等更容易被禽流感病毒污染。由于活禽交易市场、宰杀加工场所汇聚了不同来源的活禽，监测发现存在一种标本同时检出2种以上亚型禽流感病毒，说明交叉污染隐患大，有可能增加不同亚型病毒之间重配的风险，而且一些场所条件简陋，从业人员防护意识差，暴露机会多，感染发病的风险较高。

从目前的一些研究结果来看，禽类暴露或与禽类密切接触是人感染禽流感的危险因素之一^{[15, 16, 17, 18]}。因此，为防止人类感染禽流感，建议丽水市有条件的地区关闭活禽交易市场，活禽定点宰杀后以白条鸡(包括鸭、鹅、鸽等)上市销售，减少污染环节。对于条件不具备的地区，要加强活禽交易市场和宰杀场所的监管，加强交易场所与宰杀场所的清扫和消毒，增强交易人员的防护意识与防护措施，尽可能降低人感染禽流感风险。此外，应开展职业暴露人群禽流感感染水平和危险因素暴露的监测研究，继续深入开展禽流感病毒动态分布趋势以及致病力和传播能力的监测，评估流行风险，以便采取更具针对性的防控措施。