流行性乙型脑炎(Janpanese encephalitis，乙脑)是一种蚊媒传播的急性中枢神经系统传染病，主要流行于亚洲及太平洋地区^[1]。在我国，几乎所有省(直辖市和自治区)均有本病流行^[2]。云南省地处我国西南边境地区，与东南亚诸国接壤，属于热带、亚热带气候，适宜蚊虫和蚊媒病毒传播，乙脑分布范围广，发病率高^[3]。此前，已从云南省不同地区的乙脑患者、蚊虫、鸟类和蝙蝠中分离出数十株乙脑病毒(Janpanese encephalitis virus，JEV)^{[6, 7, 8, 9, 10, 11]}。为阐明云南省近期JEV流行株的分子生物学特征及基因型，本研究对云南省新分离的4株JEV进行了全基因组序列测定和分析。

本研究使用4株JEV，其中YN09M57株于2009年7月分离自滇中地区弥勒县三带喙库蚊(Culex tritaeriorhynchus)，DH10M865、DH10M978和DHL10M62病毒株于2010年8月分别分离自滇西地区芒市、瑞丽市和盈江县的三带喙库蚊，均为细胞培养法分离并保存的病毒株。

采用小白鼠颅内接种法，选择昆明种3日龄乳小白鼠(大理大学实验动物中心提供)，母鼠与乳鼠同窝饲养观察2 d，它们哺乳正常且精神状态良好者进行感染试验。用病毒分离物的细胞培养上清液接种乳鼠，每株病毒接种10只乳鼠，另设一窝乳鼠及其母鼠为对照。每天观察发病状况，如乳鼠发病处于濒死症状时，解剖取脑组织制成接种液，再传代一次，乳鼠规律发病者剖取脑组织制备病毒悬液，－20 ℃冰箱备用。

取活化后的病毒上清液，用QIntmp Viral RNA Mini Kit(美国QIAGEN公司)提取病毒RNA，用Amersham Bioscience Ready-to-Go^TM You First-Strand Beads(美国Amersham Pharmacia Biotech公司)制备cDNA。用于PCR扩增的JEV全基因组序列的16对引物^[10]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用GoTaq Green Master Mix (美国Promega公司)试剂盒完成PCR扩增。

所有测序均在北京博迈德科技发展有限公司完成。使用DNAstar软件包中的SeqMan对序列片段进行拼接、编辑、校正。用Clustal X(1.83)、DNAstar中的MegAlign软件完成JEV核苷酸和氨基酸同源性分析；用GENEDOC3.2软件进行氨基酸差异位点分析；用Mega 4.0软件及Neighbor-Joining 法构建系统进化树，Bootstrap值设定为100。本研究引用GenBank中不同年代、国家、地区和宿主的JEV全基因组序列39株，其中Ⅰ型9株，Ⅱ型1株，Ⅲ型27株，Ⅳ型1株，Ⅴ型1株；E基因53株，包括Ⅰ型29株，Ⅱ型2株，Ⅲ型19株，Ⅳ型2株，Ⅴ型1株。

本研究云南省4株JEV均能在乳鼠脑内增殖，并能引起乳鼠规律发病和死亡。感染乳鼠发病潜伏期为60~70 h。主要表现为拒乳、离群、弓背，最终四肢抽搐、呼吸衰竭直至死亡，发病至死亡间隔时间为10～15 h。所有乳鼠在接种后70~85 h死亡。

经序列测定，获得这4株JEV的全基因组序列。其中YN09M57株基因组全长10 967 bp，5′非编码区含有96个核苷酸，3′非编码区含有572个核苷酸，从97位到10 395位为开放阅读框(ORF)，共编码3432个氨基酸；DH10M865、DH10M978和DHL10M62株基因组全长均为10 965 bp，5′非编码区含有96个核苷酸，3′非编码区含有570个核苷酸，从97位到10 395位为开放阅读框，编码3432个氨基酸。DH10M865、DH10M978、YN09M57和DHL10M62的全基因组序列已提交到GenBank，序列接受号依次为KT229572、KT229573、KT229574和KT229575。

云南省4株JEV与来源于GenBank中的39株不同基因型JEV及外群病毒MVE-1-51株(墨累山谷脑炎病毒Murray valley encephalitis virus)的全基因组核苷酸序列构建系统进化树，云南省4株JEV间亲缘关系较近，并与9株基因Ⅰ型JEV参考株处在同一进化簇中，均属基因Ⅰ型，但YN09M57和DHL10M62与DH10M865和DH10M978株之间存在一定差异。YN09M57和DHL10M62株与2004年分离自日本猪血清的Mie40株(AB241118)同在一个小分支；而DH10M865和DH10M978株则与HEN0701株(FJ495189)同处一个小分支。云南省4株病毒与基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型JEV亲缘关系较远，与外群病毒MVE-1-51株差异较大，见图 1。

图 1 基于乙脑病毒全基因组序列的系统进化分析 Figure. 1 Phylogenetic trees based on full length genomes of Japanese encephalitis virus 注：●为本次云南分离株。

图选项

云南省4株JEV与来自GenBank中53株不同基因型JEV和外群病毒MVE-1-51株的E基因核苷酸序列构建系统进化树，云南省4株同在一个分支，但YN09M57和DHL10M62株与DH10M865和DH10M978株分属2个小分支。这4株与29株基因Ⅰ型JEV参考株均处在基因Ⅰ型进化支中，均属基因Ⅰ型。其中YN09M57和DHL10M62株与2004年分离自中国四川的SC0416和SC0412株(DQ 404092和DQ 404090)及2002年分离自越南的02VN22分离株(AY376465)亲缘性最近，而DH10M865和DH10M978株仅与2004年分离自中国四川省的SC0425株(DQ 404094)亲缘关系最近。云南省4株病毒与基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型JEV的进化关系稍远，与外群病毒MVE-1-51株差异较大，见图 2。

图 2 基于乙脑病毒E基因区段的系统进化分析 Figure. 2 Phylogenetic trees based on E gene of Japanese encephalitis virus 注：●为本次云南分离株。

图选项

云南省4株JEV全基因组间核苷酸和氨基酸同源性较高，分别为98.3%～99.9%和99.5%～99.9%，它们与来自GenBank的7株基因Ⅰ型JEV(Mie40、HEN0701、Ishikawa、XJ69、 SH17M-07、 KV1899和K94P05)的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.3%～99.9%和99.7%～99.9%；与基因Ⅱ型FU株(AF217620)、Ⅲ型8株、Ⅳ型JKT6468株(AY184212)、Ⅴ型Muar株(HM596272)的核苷酸(氨基酸)最高同源性依次为89.7%(98.1%)、88.9%(98.4%)、83.3%(95%)、78.7%(91.4%)；与乙脑减毒活疫苗株(SA14-14-2)核苷酸和氨基酸最高同源性分别为88.5%和97.6%。结果表明，无论核苷酸或氨基酸在同型间均具有较高同源性，与其他型同源性较低，同样证实云南省4株JEV均为基因Ⅰ型。

云南省4株JEV的全基因组间存在18处氨基酸位点差异，其中C、PrM、E和NS蛋白分别存在2、8、1和7个位点差异。云南省4株JEV与SA14-14-2株全基因组氨基酸比较，有96处位点差异，其中C、PrM、E和NS蛋白分别存在7、11、15和63个位点差异。云南省4株JEV的E蛋白核苷酸及氨基酸均无插入和/或缺失，与毒力相关的8个重要位点(E107、E138、E167、E177、E264、E279、E315、E439)中存在7个位 点差异，仅E167位点同为F，但云南省4株JEV的E138位仍为谷氨酸(E)，见表 1。云南省4株JEV与SA14-14-2株在E蛋白重要抗原表位相关的结构域Ⅰ(E1-E 51)、Ⅱ(E 52-E 137、E 197-E 292)和Ⅲ(E 310-E 411)的位点相同。

在5′核苷酸序列中，云南省4株JEV间在位点10、11、12和25存在差异，其中YN09M57和DHL10M62株上述位点分别为T、T、T、G，而DH10M865和DH10M978株的上述位点分别为A、A、C、T。这4株与引自GenBank的7株基因Ⅰ型 (Mie40、HEN0701、Ishikawa、XJ69、 SH17M-07、 KV1899和K94P05) 的5′非编码区核苷酸序列存在12处差异，3′非编码区10 410～10 411位点中存在2个核苷酸缺失；与SA14-14-2株的5′非编码区核苷酸序列存在9处位点差异。

JEV属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，单股正链RNA病毒，其氨基酸编码一个多聚蛋白，形成3个结构蛋白(C、PrM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。本研究基本阐明了云南省新分离4株JEV的分子生物学特征及其与国内外流行株的进化关系。云南省4株JEV与GenBank中不同来源的基因Ⅰ型JEV全基因组序列的比较，它们的氨基酸编码数目相同，尽管在结构蛋白和非结构蛋白中某些核苷酸和氨基酸位点存在一些差异，但均不属于JEV重要位点。

E蛋白是JEV颗粒表面最重要的成分，形成病毒的表面抗原决定簇，具有血凝活性和中和活性，能够刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击，参与病毒的吸附、穿入、致病并与诱导宿主的免疫应答密切相关^[12]。JEV活疫苗株SA14-14-2是我国广泛使用的乙脑疫苗，本次用该疫苗株与云南省4株JEV进行比较，在E基因区域内共有15个氨基酸差异，其中决定毒力的8个重要位点^{[12, 13]}中存在7个氨基酸差异。E 138位点被认为是影响JEV毒力最重要的位点，如果该位点由谷氨酸(E)替换成赖氨酸(K)，则病毒的神经毒力就会明显降低^{[14, 15, 16, 17]}，而云南省4株JEV该位点未发生改变，表明毒力未降低。此外，在E蛋白3个结构域(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中，结构域Ⅰ具有血清学和生物学活性，结构域Ⅱ具有中和及血凝活性，结构域Ⅲ是重要抗原表位。结构域Ⅰ和Ⅱ在空间结构上紧密相连，而结构域Ⅲ则独立地在病毒表明折叠成为免疫球蛋白的结构，许多抗原中和表位相关的重要氨基酸位点集中于结构域Ⅲ^[18]，尤其是E337~E345、E377~E382、E397~E403三个区域，如这3个区域发生变异会导致病毒抗原改变，影响抗原与中和抗体的结合反应^[19]。本次云南省4株JEV与SA14-14-2株在上述3个区域位点完全一致，提示云南省新分离JEV抗原性未发生改变，我国现在使用的减毒活疫苗SA14-14-2株理论上能够有效保护新分离毒株的感染。综上所述，云南省新分离JEV决定病毒抗原和毒力的氨基酸关键位点与国内外不同时期流行株基本相似，提示自然界JEV流行株具有较好的遗传稳定性。

JEV的基因分型最初采用PrM/C区段作为分型依据，后来用E基因作为分型依据，而目前最能全面准确地描述JEV的分子生物学特征是对全基因组序列进行分析，可将JEV分为Ⅰ～Ⅴ基因型^[20]。目前，我国存在基因Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型的流行^[11]，以往我国广泛流行基因Ⅲ型，而基因Ⅴ型仅于2009年分离自西藏墨脱县蚊虫^[11]。全基因组序列分析证实，我国基因Ⅰ型JEV最早于1977年和1982年分离自云南省大理和西双版纳州的蚊虫中^[10]，随后，直至2001年从捕自上海市的蚊虫中分离到基因Ⅰ型JEV以来，各地相继分离到该型病毒^{[6, 7, 8, 11, 21, 22, 23]}。本研究通过对不同来源的5个基因型JEV的全基因组同源性和系统进化分析证实，最近从云南省不同地区蚊虫中分离到的这4株JEV与国内外不同时期的基因Ⅰ型流行株具有较高的同源性和较近的进化关系，进一步证实基因Ⅰ型JEV已成为云南省的主要流行型。进化树分析还发现，云南省4株JEV无论是全基因或单独E基因序列，均形成2个不同小分支(图 1、2)，其中YN09M57和DHL10M62株与越南等东南亚流行株亲缘关系更近，而DH10M865和DH10M978株则与邻近省四川省流行株亲缘关系更近，推测属于不同来源的株系，具有一定的流行病学意义。