自从1985年首次报道了人类免疫缺陷病毒(HIV)的完整核酸序列以来^[1]，研究人员获得了大量的HIV核酸序列信息，使HIV的分子流行病学研究迅速得到发展。根据各核酸序列的分子系统发育(molecular phylogenetics)分析，在全球范围内普遍流行的HIV-1型可以分为M(Main)、 N(Non-M-Non-O)、 O(Outlier)和P 4个组(group)，其中最主要的M组可以分为A、 B、 C、 D、 F、 G、 H、 J和K亚型(subtype)^[2]。该分类系统并不是静态的，近年来还报道了许多广泛流行的重组亚型(circulating recombinant forms，CRFs)。了解一个地区的HIV-1基因亚型分布可以更好地预测该地区病毒的进化和传播趋势。本研究旨在为我国HIV分子流行病学研究人员提出一种合理、详尽、可行的HIV-1基因分型方法。

在Los Alamos国家实验室的HIV核酸序列数据库中查找参考HIV核酸序列，在保守序列部分设计扩增的引物，并且确保扩增的序列位于Env基因的C2-V3区和Gag-Pol区。本实验设计的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)引物和nested PCR引物见表1。

在南昌市男性性接触人群(MSM)监测哨点内，确证为HIV阳性的患者中选取3个样本，登记其基本信息及流行病学资料。抽取患者的抗凝静脉血5 ml，离心获得血浆-80 ℃保存备用。

取1 ml 的血浆用Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan仪器(Roche)测量HIV病毒载量。操作步骤按仪器和试剂的说明书进行。

将300 μl的血浆采用Maxwell 16 viral total nucleic acid purification kit (Promega)提取HIV RNA，提取的病毒RNA采用TaKaRa公司的One-step RT PCR kit进行RT-PCR扩增。取5 μl的RNA按照试剂盒的反应说明书进行RT-PCR，其中扩增Gag区时样本的退火温度设为55 ℃，扩增Env区时样本的退火温度设为56 ℃。扩增产物直接用双蒸水稀释100倍保存于4 ℃冰箱待下一步巢式PCR用。

取10 μl 100倍稀释的扩增产物按照TaKaRa公司的Ex Taq酶的反应说明书配置50 μl反应体系，按94 ℃ 30 s、55 ℃(Gag)或56 ℃(Env)30 s、72 ℃ 1 min设置反应程序，共进行30次循环。取3 μl PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，105 V，20 min。

将PCR扩增之后的电泳呈明显单一条带的核酸送交Invitrogen公司进行测序，测序引物与nested PCR引物相同。获得的序列用Mega 6软件进行序列编辑、比对及遗传距离计算，构建出Env和Gag基因片段的分子进化树，通过其判断该序列的基因亚型。

3例患者的流行病学资料和HIV病毒载量见表2。3例患者都是通过男男高危性行为感染HIV，均接受过抗病毒治疗，其中MSM-1和MSM-3体内只有微量病毒(小于仪器的最低检测浓度20 copies/ml)。

提取样本核酸后进行RT-PCR，获得cDNA片段，将其直接稀释后再进行巢式PCR，所获得的目的片段进行琼脂糖凝胶电泳后所得HIV的Gag片段与Env片段见图1。

图1 MSM-1和MSM-2的Gag基因片段、MSM-3的 Env基因片段的电泳结果 Fig.1 Electrophoresis of Gag and Env region of MSM-1 and MSM-2

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将上述扩增获得的基因片段进行测序，取得的核酸序列用Mega软件与Los Alamos实验室的HIV分型参考核酸序列进行剪接、比对^[3]，分别以O组HIV(GenBank序列号为AY 169804)和N组HIV(GenBank序列号为GQ 324958)为外部组(outgroup)，采用最大似然性[JP2]方法生成分子进化树，见图2。根据图中的分类单元显示，MSM-1、MSM-2、MSM-3三个样本的HIV-1亚型均为CRF01_AE型。

图2 以Gag和Env片段构建的分子系统发育树 Fig.2 Molecular phylogenetic trees of Gag and Env gene 注：采用最大似然性方法构建，节点上的数字表示600次bootstrap检验的百分值，仅显示大于60%的，研究样本以“△”标示。

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HIV-1的Env基因的高度变异区V3环(V3 loop)是一个主要的病毒嗜性及抗体中和决定簇^{[4, 5]}。笔者将MSM-3与B、01_AE亚型序列的V3环进行氨基酸比对(图3)，发现其更接近于01_AE亚型，两者之间没有缺口(gaps)，氨基酸匹配度为83%，相似度高达97%(相似度另外包括功能相似的氨基酸)。虽然V3环的顶端特征四肽G-P-G-R中，该样本的最后一个氨基酸由R(精氨酸)变异为Q(谷氨酰胺)，但两者的功能是相似的。

图3 MSM-3 Env区V3环氨基酸比对 Fig.3 Alignment of the amino acids in v3 loop of MSM-3 Env region 注：括号里标注的是亚型，序列中的短横线代表缺口(gaps)，特征四肽已用矩形框住。

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目前我国各地的HIV分子流行病学的研究已有很多，但是大多数没有详细、可操作的完整实验流程，本研究可以为国内同行提供方法学上的一个详尽、有益的参考。在优化HIV基因分型方法中，最关键的是引物设计。目前一般是对HIV Env基因的C2-V3区进行测序，或者是Gag-Pol区。本研究将不同基因亚型的HIV基因进行比对，选定Env基因和Gag-Pol区中的保守部分作为设计引物的位点，从而增加对不同基因亚型HIV-1的扩增效率。本研究中的MSM-1和MSM-3样本的病毒载量均＜20 copies/ml，但依然扩增出来明显的单一条带，说明该引物对于血浆中的HIV基因扩增灵敏度比较高。不同于以往实验中用2个基因片段来确定HIV-1亚型，本研究仅用1个基因片段，但有文献报道采用了GP41区1个小的基因片段(460 bp)依然可以获得很好的分型结果^[6]，笔者扩增出来的片段分别为879 bp(Gag)和882 bp (Env)，而且本实验获得的分子进化树中样本与CRF01_AE有高相似度。本实验的样本来自江西省南昌市的MSM人群，在2012年的一项全国HIV-1分子流行病学调查中^[7]，江西省的CRF01_AE占绝大多数，与本次实验的结果相符。

图1中可见3个样本均扩增出明显的单一条带，而MSM-3的Env片段浓度更高，表明Env区段引物的特异性更好，而MSM-1和MSM-2的Gag片段的浓度对于成功测序也是足够的。本实验中MSM-3 Env基因区的V3环非常接近于CRF01_AE亚型的氨基酸序列。V3环的特征四肽G-P-G-R是抗体结合的关键位点，而MSM-3的特征四肽与CRF01_AE亚型在最后一个氨基酸位点虽然发生了变异，但两个氨基酸的功能类似，这些数据可以为进一步的结构学奠定基础。

本研究设计了一组有效的HIV-1基因分型引物，提供了一个合理、详尽的HIV-1基因分型操作步骤。