艾滋病最早于1981年发现于美国的男男性行为者(men who have sex with men，MSM)，男男同性行为传播人类免疫缺病毒(HIV)已成为中国目前重要的传播途径，中国MSM的人群估计数为50万~100万^[1]，2013年19月新发现的HIV感染者和患者中经性传播占89.9%，其中经同性传播占20.8%^[2]。该人群的HIV高感染率持续不下，其高危行为已逐渐成为潜在的公共危害问题，对该人群的调查和干预已成为艾滋病防控的一项重要工作。笔者对绍兴市20132014年新确证的50例MSM HIV感染者的流行病学和基因特征进行分析研究，了解绍兴市MSM人群的行为学特征和HIV-1毒株亚型分布情况，建立本地区HIV分子生物学数据库，为防控工作提供依据与参考。

2013年1月至2014年7月新确证的50例MSM HIV/AIDS感染者血浆样本，均未进行抗病毒治疗。流行病学基本信息来自中国疾病预防控制信息系统。

病毒RNA提取试剂盒采用Roche公司的 High Pure Viral RNA Kit，病毒反转录采用TaKaRa公司的TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)试剂盒，扩增使用TaKaRa公司的LA Taq酶。PCR扩增仪由美国ABI公司生产，凝胶成像仪为Alphalmagep EP。

提取200 μl血浆样品中HIV RNA，以提取的RNA为模板，采用反转录-聚合酶链反应 (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和巢式-聚合酶链反应 (nest transcription-polymerase chain reaction，nest-PCR)方法扩增HIV-1的gag基因区全长1594 bp，pol基因区全长3097 bp，引物序列见表1，扩增条件见参考文献[3]。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，经DNA Marker对照确认是否含目的片度，目标产物直接送至上海华大基因公司进行纯化并测序。

测序返回的序列使用Contig Express软件对序列进行编辑、拼接和校正，从HIV dabase(http：//www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/search/search.html)下载各种亚型的标准序列作为参考株，应用Bio-edit软件对样本序列和标准序列进行比对和校正，用Mega 5.2软件构建Neighbor-Joining系统进化树分析，确定各区亚型，同时进行在线HIV-Blast亚型判断。重组样品用Simplot 3.51软件做断点分析。

流行病学调查显示感染者均通过男男性行为感染，46例扩增成功的感染者平均年龄32.22岁，以20~39岁为主；学历在中学及以上的HIV /AIDS占95.65%(44/46)；职业以农民/工人为主，占50%(23/46)；本地户籍感染者占69.57%(32/46)。86.96%(40/46)的感染者有2个以上的性伴，平均性伴个数为4.78个，21例已婚或离异/丧偶，25例未婚，28例感染者表示曾与异性发生无保护的性行为，见表2。

成功扩增46份样品，其中gag基因35份，扩增率70%，pol基因35份，扩增率70%。

46份样品用Neighbor-Joining连接法对gag/pol基因序列分别构建进化树(图1、2)，共发现CRF01_AE、CRF07_BC和B三种亚型，其中CRF01_AE亚型24人，占52.17％，CRF07_BC亚型18人，占39.13％(18／46)，B亚型3人占6.52％(3／46)，1份样品结果分型不一致，为重组样品，占2.17%。24份有2区结果的样品中23份2区结果的分型一致，其中CRF01_AE亚型13份，CRF07_BC亚型9份，B亚型1份；22份样品仅成功扩增1个基因区，其中gag基区11份，包含CRF01_AE亚型4份，CRF07_BC亚型5份，B亚型2份，pol基因区11份，包括CRF01_AE亚型7份，CRF07_BC亚型4份。各亚型通过拉莫斯国家实验室核酸序列库软件在线比对，显示CRF07_BC与云南及广西报告的病毒序列相近，B亚型与河南输血传播的病毒序列相近，CRF01_AE亚型与北京、辽宁在MSM人群中分离到的CRF01_AE相近。

图 1 HIV-1 gag 区系统进化树 Figure 1 Phylogenic tree of HIV-1 gag gene

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图 2 HIV-1 pol 区系统进化树 Figure 2 Phylogenic tree of HIV-1 pol gene

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本研究中1份样品为重组毒株，感染者为39岁已婚有配偶男性，职业经商，无吸毒史。在进化树上gag基因靠近CRF01_AE亚型，pol基因靠近CRF07_BC亚型，Simplot断点分析显示pol区基因为CRF01_AE和CRF07_BC亚型的重组，其两端为CRF01_AE亚型，中间插入了3段CRF07_BC亚型基因，其中660~1560 bp和1780~2260 bp插入了2段较大的CRF07_BC基因，编码了该毒株的反转录酶，该毒株的蛋白酶和整合酶由CRF01_AE亚型编码。Bootscan图谱分析见图3。

图 3 20130212 HIV pol序列Bootscan分析 Figure 3 Bootscanning analyses of 20130212 HIV-1 pol gene sequence

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绍兴市MSM人群20122014年哨点监测HIV阳性率平均为3.42%，低于浙江省的平均水平^[4]，也低于其他地区的感染率^[5,6] 。在本次调查中，绍兴市及浙江省户籍MSM占69.57%，表明HIV已经在本地区户籍的男同人群中广泛传播。2013年绍兴市MSM哨点监测的结果显示该人群的艾滋病知晓率为94.93%，而每次使用安全套的比例仅49.29%；感染者平均有4.78个性伴，60.87%(28/46)与异性有无保护性行为，表明该人群“知-行”分离、多性伴及双性行为的行为特点，是继外来务工人员后HIV传播的重要桥梁人群。相比欧美国家，我国MSM结婚比例较高，随年龄增长，MSM已婚比例迅速上升^[7,8,9]，本次调查的46名同性恋感染者中有21人已婚或者离异／丧偶，平均年龄40.24岁，明显高于25例未婚MSM的平均年龄(25.28岁)，同性恋者在中国受到社会歧视与道德歧视较欧美国家更为严重，受到传统的“传宗接代”的思想的影响，因此随着年龄增长，以结婚的方式来掩饰其同性取向，部分婚后也与异性发生无保护性行为，导致异性性伴感染的风险^[9,10]。

本次研究在MSM HIV感染人群中共发现CRF01_AE、CRF07_BC和B 3种主要亚型，与其他地区流行的主流亚型相同。在线序列比对显示CRF07_BC的序列接近于广西壮族自治区(广西)和云南省HIV序列，由于绍兴艾滋病散发期的HIV感染者主要来自广西(33.93%)、新疆(14.29%)和云南(8.93%)这3个省(自治区)，因此结合流行历史CRF07_BC亚型可能直接由广西、云南省(自治区)的外来吸毒务工感染者引入并通过性接触引起在本地区广泛传播。B亚型在绍兴所占比例较少(6.42%)，序列接近于河南毒株，估计因地域距离原因，绍兴不是河南及其周边地区劳动力流动的主要方向，因此来自河南有偿献血的B亚型在本地区的MSM中没有大量流行。CRF01_AE与辽宁省MSM人群中报道的序列相似性较高，辽宁省MSM人群中有2个独立来源的CRF01_AE亚型，其祖先为不同的泰国株，1种经由东南沿海传入北方地区，另1株经云南省传入^[11]。绍兴市所在浙江省位于东南沿海，交通便利，我们推测MSM人群的CRF01_AE亚型由旅行者从泰国携带传入并在东南沿海传播的可能性比较大^[12]，但更直接的证据有待于进一步研究。CRF01_AE亚型在进化树上呈多系分支状，表明其感染源的多样化，可能来源于泰国不同时期、不同地区的不同菌株，由于这些菌株间很难重组，所以随着时间的推移，仍呈现多系分支状^[13]。

虽然MSM人群中HIV流行毒株的多样性要低一些，但该人群的亚型正趋向复杂，本次研究中出现的 1例CRF01_AE和CRF07_BC重组亚型，反映了HIV的高度变异性，这2种流行最广泛亚型的重组可能导致新亚型的出现和流行。由于引物特异性和样本浓度等问题导致22份样品仅扩增出1个基因区是本次研究的不足之处，可能导致样品部分重组情况被忽略。作为艾滋病传播的高危人群，对该人群进行及时有效的宣传、干预和亚型监测，是绍兴市今后艾滋病防治工作的重点。