咽扁桃体炎感染在儿童中极为常见，是导致儿童就医的主要原因之一。A组链球菌(Group A streptococcus，GAS)是引起儿童咽扁桃体感染的重要病原体^[1]，GAS致病谱广泛，可导致免疫相关性，侵袭性及非侵袭性感染等多种疾病。M蛋白是其一种表面结构，与致病菌的黏附、定植和侵入人体皮肤黏膜致病有关。编码M蛋白的M蛋白基因(encoding mature M protein gene，emm)具有很高的型特异性^[2]，根据这一特点，可以对GAS进行emm分型。2011年北京市猩红热病例与往年相比明显增多，同时由GAS引起的咽扁桃体炎病例也呈增加趋势，为了探索引起咽扁桃体炎的GAS emm型别变化趋势，本研究对20112014年北京市咽扁桃体炎病例分离到的GAS emm型别数据进行分析，以期了解其emm型别构成和感染不同emm型别患者的特点，为GAS引起的疾病防治提供理论参考。

于20112014年的57月对北京市18个区(县)的36家哨点医院儿科门、急诊就诊的病例采集咽拭子标本，病例临床诊断为咽扁桃体炎，咽拭子标本实验室GAS分离培养阳性。

根据患者的病历收集人口学特征信息、主要临床表现、临床检查结果和临床诊断结果等。根据患者的就诊医院划分发病地区。其中，中心城区包括东城区、西城区、朝阳区、海淀区、丰台区、石景山区；北部地区包括昌平区、怀柔区、顺义区、平谷区、延庆县和密云县；南部地区包括房山区和大兴区；西部城区包括门头沟区；东部地区包括通州区。

经患者知情同意，应用北京市疾病预防控制中心(CDC)统一提供的咽拭子采集患者口腔咽拭子标本，将采集的咽拭子直接浸入采样肉汤液中，24 h内送至各辖区CDC实验室进行检测。首先，将咽拭子标本接种于50 ml／L脱纤维羊血的胰大豆蛋白胨血琼脂平板上，于 37 ℃，体积分数为5％的CO₂恒温箱中孵育24 h。根据血平板的形态特征及其β溶血环挑取可疑菌落，应用英国Oxoid公司生产的链球菌分群诊断试剂进行鉴定。

应用上海之江生物科技有限公司提供的细菌DNA提取试剂提取GAS的DNA，用一次性接种环刮取菌落，悬浊于100 μl提取液中，沸水浴10 min，置于离心机中转速13 400 rpm，离心5 min，取上清。emm分型区检测引物与测序引物及普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)反应体系的配置均参照美国CDC网站(http：//www.cdc.gov/treplab/protocol-emm-type.html)。引物序列：emm上游引物为5′-TAT TGG CTT AGA AAA TTA A-3′，下游引物为5′-GCA AGT TCT TCA GCT TGT TT-3′，测序引物为5′-TAT TCG CTT AGA AAA TTA AAA ACA GG-3′。PCR反应体系为：10×buffer (with 15 mmol/L MgCl₂) 2.5 μl；dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μl；Primer 1 (70 pmol/μl) 0.5 μl；Primer 2 (70 pmol/μl) 0.5 μl；Taq Polymerase (3 U/μl) 0.18 μl；dH₂O 19.82 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸5 min；产物4 ℃恒温保存。扩增产物交由英潍捷基公司进行测序获得核酸序列，最后将序列提交到美国CDC链球菌实验室网络数据库进行同源性比对(http：//www.cdc.gov/streplab/strepblast.html)，在一个emm基因序列中，如果前180个碱基中超过95%与数据库中的某一型别参照基因序列一致，则认定与参照基因为同一emm基因型，否则视为新基因型。

用EpiData 3.1软件建立数据库，进行emm基因型别数据双录入。使用SPSS 13.0软件进行统计分析。采用χ²检验和Fisher精确概率检验比较不同人群、不同地区的emm基因型别的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

研究共纳入符合入选条件的咽拭子标本784例，排除病例临床信息缺失45例，共有739例标本最终被纳入到研究中。其中，2011年251例，2012年191例，2013年87例，2014年210例；所有研究对象中，男性437例(59.1%)，女性302例(40.9%)；年龄中位数是6.63岁，5岁以下病例142例(19.2%)，5岁以上病例591例(80.8%)；病例主要分布在中心城区(52.4%)和北部郊区(34.8%)。见表1。

739株GAS中，共鉴定出10种emm基因型，32种emm基因亚型，emm基因型中，emm12所占比例最高，为62.2%(460/739)，其次是emm1，占35.0%(259/739)；emm基因亚型中，emm12.00比例最高，为53.2%(393/739)，其次为emm1.00，占31.9%(236/739)，再次是emm12.19，占6.2%(46/739)，这3种亚型占总数的91.3%(675/739)。20112014年，emm1.00所占比例分别为19.5%(49/251)、25.7%(49/191)、42.5%(37/87)和48.1%(101/210)，emm12.00所占比例分别为68.1%(171/251)、57.6%(110/197)，34.5%(30/87)和39.0%(82/210)。本研究还发现几种新emm亚型，如st1258和st485。见表2。

emm1人群的平均年龄为6.91±3.65岁，emm12人群的平均年龄为6.37±2.55岁，两者的平均年龄的差异有统计学意义(t=2.32，P=0.021)。emm1和emm12男女构成比分别为155/104和271/290，两者差异没有统计学意义(t=0.09，P=0.76)。在地区分布上，emm1型感染者主要分布在北部郊区(49.4%)，其次是中心城区、东部郊区、南部郊区和西部郊区；emm12主要分布在中心城区(59.8%)，其次是北部郊区、南部郊区、西部郊区和东部郊区，两种基因型的地区分布差异有统计学意义。20112014年，emm1的型别构成比逐年增加，而emm12的构成比逐年降低，型别分布差异有统计学意义(χ²=70.24，P<0.05)，同时，emm1.00和emm12.00的型别分布差异也有统计学意义 (χ²=58.20，P<0.05)。见表3。

咽扁桃体炎主要致病菌除了GAS外，还包括肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、甲型溶血性链球菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等常见致病菌^[3] 。本研究中涉及的咽扁桃体炎病例全部为GAS感染，与引起猩红热的主要致病菌一致。emm基因编码的M蛋白是GAS感染性疾病的重要致病因子，emm基因型被证实与不同的 GAS 感染性疾病间存在联系^[4]。GAS的emm型别分布具有国家和地区差异性^{[5, 6]}，近年来，我国引起咽扁桃体炎和猩红热的GAS emm型别以emm1、emm12和emm22为主^[7]，与欧美等国家主要emm型别有很大差异^{[8, 9, 10]}。在北京地区儿童GAS感染病例中，emm12基因型菌株感染所占比例最大，其次是emm1^{[11, 12]}。本研究涉及北京地区20112014年从咽扁桃体炎病例中分离的739株GAS，检测到10种emm型别。而19931994年及20052006年北京地区的GAS感染儿童病例中分别检测到24 种和9种 emm基因型^[13]；2011年GAS感染病例中检测到8种emm基因型。由此可见，随着时间变化，北京地区GAS的 emm 基因型分布特点也发生了明显变化，emm基因型谱分布变窄后，近年来趋于稳定，优势型别主要集中于emm12和emm1^{[12, 13]}。

本研究中男性感染者所占比例高于女性，患者年龄中位数为6.63岁，病例主要集中于中心城区和北部郊区。这与以前对北京地区的GAS感染病例的研究结果一致^[12]。在对主要基因型别emm1和emm12及主要亚型emm1.00和emm12.00分别进行分析发现，它们的地区分布构成比差异均有统计学意义(P<0.05)。基因型emm1及其主要亚型emm1.00在北部郊区所占比例最高，其次是中心城区；基因型emm12及其主要亚型emm12.00在中心城区所占比例最高，其次是北部郊区。由于GAS感染人群主要是儿童，结合北京市不同地区地理环境，人口密度，医疗资源分布及人群生活习惯等因素分析，可认为是由于北京市大型儿童专科医院及综合医院都集中分布于中心城区，不同年龄段患者选择就医医院的习惯等原因造成emm主要基因型的地区分布差异，但具体原因有待于进一步研究证实。

本研究发现，20112014年，北京市主要emm型别比例发生了明显变化。20112012年，emm12为主要emm型别，所占比例高于emm1。但随后的两年中，emm1比例超过了emm12，成为主要emm型别。这一变化表明，北京市咽扁桃体炎病例GAS的主要emm型别未发生改变，但是emm12所占比例呈现下降趋势，而emm1所占比例不断上升，已取代emm12成为目前北京地区主要emm型别。结合其他研究者对20032008年北京地区分离的GAS emm型别研究结果^[11]，可认为北京地区主要emm型别处于一种动态变化中。由于以往研究对emm基因型与GAS感染性疾病间的联系未有明确定论，因此这种变化趋势对北京市GAS感染病例的临床分类和严重程度的影响还无法判断，二者之间的确切联系需要进一步研究证实。

本研究显示北京市emm基因型谱近年来趋于稳定，虽然主要emm型别所占比例发生变化，而且有新的emm基因型被发现，但是主要emm型别依然为emm1和emm12，主要emm基因亚型为emm1.00和emm12.00，与其他研究者对北京和全国其他地区猩红热病例分离GAS的型别构成相近^{[12, 14]}。由于emm基因型谱构成与GAS对大环内酯类药物的耐药情况密切相关^{[12, 15]}，因此，本研究提供的emm基因谱的构成，对北京地区GAS感染病例临床用药治疗具有积极的参考意义。本研究人群仅局限于门诊轻症病例，且只针对咽扁桃体炎病例进行研究，因此结果具有一定局限性，无法全面反映本地区GAS感染病例分离菌株emm型别分布情况。但是结合以往研究结果，同一地区同一时期内咽扁桃体炎病例和猩红热病例主要GAS emm型别及其感染人群年龄、性别分布差异无统计学意义^{[12, 14]}。因此，该研究结果仍是GAS emm基因型研究的重要方面。