我国艾滋病(acquried immunodeficiency syndrome,AIDS)感染整体呈低水平流行，但局部地区和特定高危人群呈现高流行水平，部分地区已经呈现从高危人群过渡到一般人群的流行趋势。天津市目前艾滋病病例报告较少，但男男性行为人群(men who have sex with men,MSM)已成为天津市艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染最重要的人群^[1]。

目前艾滋病标准的筛查策略是以第三代试剂作为筛查试剂，发现阳性后进一步开展确证实验。第三代HIV筛查试剂方法比较成熟可靠，缺点是存在3～4周的窗口期。采用可同时检测血清中HIV的p24抗原和抗体的第四代HIV酶免试剂作为筛查试剂，与免疫印迹实验和核酸实验相结合的策略可以最大限度筛查早期感染者。

免疫印迹实验(WB)检测是目前我国最常用HIV确证方法,由于感染的阶段不同，HIV-1抗体产生的数量和滴度也随之发生变化，因此WB带型产生的数量和反应强度有所差别，WB条带带型中蕴含新发感染信息。捕获酶联免疫(BED HIV-1 capture enzyme immunoAssay，BED)是针对HIV-1的定量免疫检测法，用羊抗人IgG包被固相，捕获血清或血浆样本中的HIV-1特异性IgG抗体和其他IgG抗体，样本中HIV-1特异性IgG抗体和总IgG抗体的比例随感染时间的延长而增高，这种特性可以用来区别近期感染和长期感染^[2]。

本研究利用天津市现有的高危人群HIV-1抗体筛查体系，结合 BED新发感染检测技术，开展集合核酸检测进行HIV-1急性期感染筛查，并对BED检测确定的新发感染和既往感染者进行P31条带对比分析，以获得更为准确的新发感染数据，进一步探讨天津市相对适宜的艾滋病新发感染检测策略。

为2013年天津市市区自愿咨询检测门诊的MSM 2320人，在知情同意的情况下采集静脉血5 ml，所得样本经实验室离心后采集血清于-20 ℃冰箱保存备用，经三代、四代筛查试剂检测阴性和筛查阳性后确证检测不确定及阴性者。

为天津市2012-2013年部分经WB检测首次确认的HIV抗体阳性样本389份，经CD₄计数检测后95份CD₄计数≤200的样本不再进行BED检测，对294份CD₄计数>200的样本提取血浆-80 ℃保存备用。

1.1.2所述的294份感染者样本，采用美国Calypte公司的BED-CEIA试剂进行检测，用以区分近期感染和既往感染。排除标准为①当年天津市新报告病例并已经经过全国艾滋病防治综合信息系统中报告,证实为本地既往报告过或报告后被外省查重删除病例均不纳入本次。②所有CD₄细胞数<200个/ml的样品,以及从抗病毒治疗信息系统中已经登记的艾滋病患者和接受抗病毒治疗感染者的样品,视为既往感染样品,不纳入BED检测。③对于血浆量不足或发生严重溶血而不能进行新近感染检测的样品,不纳入。

先以珠海丽珠第三代HIV抗体筛查检测试剂进行筛查，筛查阳性样本做确证实验；筛查阴性的样本，采用北京万泰药业第四代HIV抗体筛查试剂盒进一步筛查，阳性样本做WB；WB不确定和阴性的样本进行核酸检测。核酸检测试剂为生物梅里埃公司的病毒载量检测试剂Nuclisens EasyQ，具体操作参照试剂说明书进行。第四代试剂筛查阴性的样本，采用集合核酸方法进一步检测。集合核酸检测：样本采用三级集合策略，首先，8份血浆样本混合形成一份一级集合样品：每份样品取100 μl，移入标记二级离心管中，再从6个二级集合管中分别吸取200 μl样品，移入三级离心管中，对每份三级集合样本进行核酸检测，若为阴性则终止检测，若为阳性，则对阳性集合进行拆分检测。

用HIV MP Diagnostics HIV BLOT 2.2 Western印迹法确认试剂(新加坡MP生物医学亚太有限公司)按照现行《全国艾滋病检测技术规范》中的标准进行结果判断，并以试剂盒中阳性对照和阴性对照中WB结果的条带深浅为参照，将阳性样本的WB条带反应强度分级评分，依次为0分(阴性)，1分(强度低于弱阳性对照)，2分(强度高于弱阳性，低于强阳性对照)和3分(强阳性)，2名专业人员进行判读，结果取均值，计算各条带反应强度得分。

WB检测首次确认的阳性样本中CD₄计数≤200个/μl 95份，判定艾滋病患者。其余294份经用BED-CEIA(美国Calypte生物公司)试剂盒进行检测，将测的吸光度(A)值通过标准品的吸光度值换算为An值，An0.8判断为感染时间>168 d的长期感染者，An≤0.8判断为感染时间≤168 d的新近感染者。

采用BD 公司FACSCalibur流式细胞仪对新发现的感染者和艾滋病患者的新鲜EDTA 抗凝全血进行CD₄⁺T细胞和CD₈⁺T细胞绝对计数。

结果应用SPSS 19.0软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

本研究对2320例MSM使用三代试剂筛查并最终确认阳性样本140例；对筛查阴性的样本2180例，应用四代试剂检测，进一步筛出19例阳性样本，进行WB 检测确认6例阳性，11例阴性，2例不确定；对13例确证阴性及不确定样本进行核酸验证，发现4例阳性；对经第四代试剂筛查后的阴性样本2161例，经集合核酸进一步检测、拆分发现阳性样本1例 ，总计检测出5例阳性。

4例核酸阳性样本WB条带结果见表 1。2例WB不确定条带结果显示gp120/gp160，其余为无条带。

117 份为新近感染，平均年龄为(32.5±10.8)岁，男女性别比为111∶6；177份为无症状期，平均年龄为(31.8±12.2)岁，男女性别比为166∶11。

结果显示，新近感染者gp160、gp120、p66、p55、p51、gp41、p31、p24和p17条带反应强度均低于无症状期感染者，差异有统计学意义(P<0.05)，见图 1。

图 1 新发感染者和无症状期感染者WB条带反应强度比较 Figure 1 Comparison of WN strip reaction between new HIV infection and asymptomatic HIV infection cases

图选项

新近感染者中p31阴性者占23.9%(28/117)，无症状期0例(0/177)，AIDS患者1例占1.1%(1/95)，结果差异有统计学意义，见表 2。

HIV感染的窗口期是由血清学检测试剂能检测出抗HIV抗体的时间决定的。三代酶联免疫法(ELISA)在感染后3周内无法检测到目标抗体，而最新的四代p24抗原-抗体联总检测法(ELISA)能将这一窗口期缩短至16~18 d。在四代试剂发挥作用的时间段之前，即HIV感染后的8~11 d左右，通过核酸试验能检测到血中的病毒RNA^[3]。HIV急性期感染 (acute HIV infection,AHI) 是初次感染HIV后的2~4周^[4]。此期的特点是病毒的快速复制、高频突变、急性免疫破坏，以及不显著的临床症状。本研究综合比较HIV筛查三代试剂、第四代试剂以及集合核酸检测方法在天津市高危人群中的应用，结果显示：三代筛查试剂具有很好的筛查效果，尤其对暗娼、吸毒两类在天津市HIV检出率及新发感染率均较低的人群具备较好优势，三代筛查及集合核酸在这两类人群中均未检出阳性者。2320例MSM样品中共计检出151例HIV阳性者，三代试剂结合WB的检测策略检测出140例阳性，敏感性为92.72%；2180例三代试剂检测阴性样品中经核酸检测证实5例阳性样品，比例为0.23%(5/2180)(95%CI：0.2%~0.75%)，与柳忠泉等^[5]2010-2012年时期的0.28%(15/5287)研究结果基本一致，天津市MSM人群急性期感染情况始终不容乐观；根据本研究结果，建议在天津市高危人群HIV筛查策略中，针对暗娼、吸毒人群可继续沿用现行的三代加WB的检测策略，而有必要将四代试剂作为MSM人群筛查的首选试剂从而形成分人群区别检测的策略组合；核酸检测在发现急性期感染者中起到比较重要的作用，因此在确证阴性或不确定样品进行核酸检测应成为必要的辅助手段。在成本允许的前提下，还可继续应用集合核酸检测策略对MSM人群中四代检测阴性样本继续筛查，最大限度发现HIV感染者。

BED法是目前应用最为广泛最成功的HIV-1新发感染率监测实验室方法，并成为其他新近感染检测方法评价的重要参照，BED法在我国具有较好的重复性和稳定性^[6]，检出新近感染的窗口期约为168 d以内。本研究中用BED-CEIA方法对294份HIV-1感染者样本进行检测，检出新近感染117份，177名无症状期。WB条带反应评分的方法对2个不同感染时期的条带反应强度进行比对，结果发现新发感染者WB各条带平均反应强度和出现频率均低于无症状期感染者，且差异有统计学意义，尤其是其中的p31条带的反应强度减弱者应高度怀疑其为新近感染。Fiebig等^[7]将原发感染分为6期，发现p31条带与HIV进展有关，在感染后23~93 d WB确证检测结果阳性，但p31条带阴性，随后转阳。提示p31条带阴性者可能为93 d内的感染。本研究在进行BED检测确定病例为新近感染的基础上对WB结果进行P31条带分析，在新近感染者中共28例p31条带阴性者，可能为23~93 d内的感染，进一步缩短了对阳性病例新近感染时间的判断。WB作为判断HIV感染的重要实验手段的同时，其结果中也蕴含了许多与疾病进展有关的信息，如果能将其结果结合BED检测结果深度利用，不仅可以了解许多有关HIV-1感染进展的信息，还可以在进行感染状况判别工作中达到节约成本和提高效率的双重效果。

目前天津市疫情绝对数字较低，容易忽略防控工作的重要性而延误控制时机，从报病数不能完全反映疫情情况，如果不能判断新检出的HIV感染者中急性期和早期感染的比例，会可能误导对疫情的判断，不利于制定切合实际的防治策略和合理分配防治的资源。综合本研究结果，根据各策略检出的HIV急性和早期感染的时间点不尽相同，我们可以重点针对天津市MSM HIV人群进行更加精确的新发感染时间估算，日常工作中单纯核酸阳性者、WB阴性或不确定的核酸阳性者、WB阳性且BED检测An≤0.8者也可继续根据P31条带情况进行相对更加明确的感染时间大致判断，由各区间的构成变化可较为直接的反映出该人群艾滋病急性感染病例的控制效果。研究显示，HIV早期感染的10~12周在血清和精液内可以检测到高水平的病毒载量^{[8, 9, 10]}。基于队列研究的数据显示，急性感染期经性传播的传染性是慢性期的26倍^[11]。尽管HIV感染急性期很短，却可以解释HIV新发感染中10%～50%HIV的传播，尤其在同时有多个性伴侣或高性伴侣变换率的人群中更为明显^{[3, 11, 12, 13]}。HIV感染急性期和早期的治疗能明显地改善疾病进展的实验室指标^{[14, 15]}。有些数据还提示HIV感染急性期治疗可降低疾病的严重程度，降低病毒的平衡点(set point)，减少病毒库的大小，减缓疾病的进展，同时抑制病毒复制和维护免疫功能来降低病毒的突变率^{[11, 16, 17, 18, 19]}。因为血液和生殖器分泌物中高浓度的病毒颗粒增加急性期HIV的传染性，所以在HIV感染急性期启动治疗也可以大幅降低HIV传播的风险^[20]。因此,在天津市积极监测HIV感染者中急性和早期感染的构成并针对该人群无论CD₄细胞计数结果而尽快启动抗病毒治疗，对于控制疫情继续增加，意义重大。

本研究尚存在一些不足之处，如各人群筛查出的早期感染样品量不多，今后还应扩大样品量继续考察策略的敏感度和特异度；本研究中集合核酸检测阳性样品有待进一步随访,获得核酸阳性样品的最终感染状况,以评估策略的准确性；因客观条件限制本研究BED结果无法避免存在小幅度的错分率，有些研究去除出了低CD⁺₄T细胞、低病毒载量和抗病毒治疗人群后，BED的特异度升高^[21]，本研究也在分析之初排除了低CD⁺₄T细胞和抗病毒治疗人群，但仍然不可能完全避免错分，只是将BED阳性和阴性的例数认定为HIV-1新发感染和长期感染的比例，并不能百分之百地反映实际情况，只能初步估计天津市高危人群的新发感染状况。