疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (2): 106-110

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王晓光, 雷永良, 叶碧峰, 茅海燕, 孙逸
WANG Xiao-guang, LEI Yong-liang, YE Bi-feng, MAO Hai-yan, SUN Yi
2014年浙江省丽水市人感染H7N9禽流感病毒分离株基因特征分析
Sequencing of genome of avian influenza A (H7N9) virus isolated from human infection cases in Lishui, Zhejiang, 2014
疾病监测, 2016, 31(2): 106-110
Disease Surveillance, 2016, 31(2): 106-110
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.02.006

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收稿日期: 2015-10-09
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王晓光, 雷永良, 叶碧峰, 茅海燕, 孙逸. 2014年浙江省丽水市人感染H7N9禽流感病毒分离株基因特征分析[J]. 疾病监测, 2016, 31(2): 106-110.
WANG Xiao-guang, LEI Yong-liang, YE Bi-feng, MAO Hai-yan, SUN Yi. Sequencing of genome of avian influenza A (H7N9) virus isolated from human infection cases in Lishui, Zhejiang, 2014[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(2): 106-110.
2014年浙江省丽水市人感染H7N9禽流感病毒分离株基因特征分析
王晓光1, 雷永良1, 叶碧峰1, 茅海燕2, 孙逸2     
1. 丽水市疾病预防控制中心, 浙江 丽水 323000;
2. 浙江省疾病预防控制中心, 浙江 杭州 310051
收稿日期: 2015-10-09
基金项目: 浙江省科技厅公益性技术应用研究计划项目(No.2012C33002)
作者简介: 王晓光,男,内蒙古自治区赤峰市人,硕士,主管技师,主要从事病毒检测与研究工作
作者贡献: 王晓光: H7N9禽流感病毒实验室检测、基因序列测定、生物信息学分析、论文撰写
雷永良: 标本采集、基因序列测定
叶碧峰: 标本采集、H7N9禽流感病毒实验室检测
茅海燕: H7N9禽流感病毒确诊检测、病毒分离
孙逸: H7N9禽流感病毒确诊检测、基因序列测定
通信作者: 孙逸,Tel:0571-87115202,Email:ysun@cdc.zj.cn;雷永良,Tel:0578-2211507,Email:ls2123365@126.com
摘要: 目的 测定浙江省丽水市1株H7N9禽流感病毒8个基因序列,从分子水平分析其基因特征和遗传变异特点。方法 对人感染H7N9禽流感确诊病例标本在P3实验室进行犬肾传代细胞培养;反转录-聚合酶链反应扩增病毒8个RNA片段后测定基因序列;通过生物信息学软件将8个序列与GISAID和GenBank数据库下载的序列进行多重比对和匹配,发现基因特征,分析病毒关键位点的分子变异情况,最大似然法绘制系统进化树用于基因进化分析。结果 从病例标本中分离到病毒:A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9),测序获得8个基因核苷酸全序列。HA裂解位点只包含2个碱性氨基酸,HA蛋白受体结合关键氨基酸位点发生A134T、G186V和Q226L变异;在PB2蛋白上发现E627K突变;M2蛋白上发现耐药位点S31N。LS01株HA基因与A/chicken/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013(H7N9)的同源性最高(98.90%),NA基因与A/chicken/Changzhou/C08/2013(H9N9)的同源性最高(98.60%),LS01株其他6个编码内部蛋白的基因均与禽源H9N2株高度同源(99.10%~99.89%)。LS01株HA和NA基因与沪苏浙一带流行的H7N9禽流感病毒株位于同一亚分支,有着直接的进化关系,在相近地域有进化关系较近的禽类流感病毒存在。结论 A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)株8个基因序列均符合禽源H7N9亚型禽流感病毒特征,其病原基因均为禽类来源。HA裂解位点具有低致病性禽流感病毒基因特点,Q226L和E627K位点发生变异可能与其对人具有高致病力相关。
关键词: 禽流感病毒    H7N9    基因    序列分析    
Sequencing of genome of avian influenza A (H7N9) virus isolated from human infection cases in Lishui, Zhejiang, 2014
WANG Xiao-guang1, LEI Yong-liang1, YE Bi-feng1, MAO Hai-yan2, SUN Yi2     
1. Lishui Prefecture Center for Disease Control and Prevention, Lishui 323000, Zhejiang, China;
2. Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, Zhejiang, China
Corresponding authors: SUN Yi, Email: ysun@cdc.zj.cn; LEI Yong-liang, Email: ls2123365@126.com
Abstract: Objectives To understand the genetic characteristics and mutation of 1 avian influenza A (H7N9) virus strain isolated in Lishui. Methods The sample was collected from a confirmed H7N9 virus infection case and the virus was cultured on MDCK cells in P3 laboratory. By using RT-PCR, the 8 RNA fragments of the cultured virus were sequenced and analyzed with bio-software. The sequences of 8 RNA fragments were multi-aligned with sequences downloaded from GISAID and GenBank. The gene characteristics and molecular mutation of key evolution-determined nucleotide sites were analyzed. Phylogenetic analysis was performed based on the phylogenetic trees. Results One human H7N9 virus strain, A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9), was successfully isolated and whole genome was sequenced. The results showed that there was only 2 basic amino acids in cleavage site of HA, 3 mutations (A134T, G186V and Q226L) occurred in the crucial sites related with the receptor of HA protein, 1 mutation (E627K) occurred in PB2 protein, and also 1 drug resistance site (S31N) was found in M2 protein. The LS01 strain's HA protein and NA protein shared 98.90% homology with that of A/chicken/Zhejiang/DTIDZJU01/2013(H7N9) strain and 98.60% homology with that of A/chicken/Changzhou/C08/2013(H9N9) strain, respectively. Phylogenetic analyses showed that other proteins were highly homologous (99.10-99.89%) with avian H9N2 viruses. The results showed that the isolated LS01 strain was directly evolved from avian H7N9 virus, which had circulated in Shanghai, Zhejiang and Jiangsu. The avian flu viruses with high similarity were also found in adjacent regions. Conclusion The characteristics of 8 RNA fragments of LS01 strain was consistent with avian-originated H7N9 subtype virus. The HA cleavage sites had the properties of low pathogenic avian influenza virus, but mutations of Q226L and E627K might be related with high pathogenicity to human beings.
Key words: Influenza virus    H7N9    Genome    Sequence analysis    

禽流感病毒基因组由8个独立的单股负链RNA片段构成，编码蛋白分别为：RNA聚合酶(polymerase 2，PB2；polymerase 1，PB1；acidic polymerase，PA)、血凝素(hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(neuraminidase，NA)、核蛋白(nucleocapsid protein，NP)、基质蛋白(matrix protein 2，M2；matrix protein 1，M1)和非结构蛋白(nuclear export protein，NEP；nonstructural protein 1，NS1)[1]。由于8个RNA片段是分开的，在两种不同亚型的流感病毒同时感染宿主细胞时，子代病毒可能获得分别来自亲代病毒的基因片段，出现基因重配[2, 3, 4, 5]；另外流感病毒的RNA多聚酶缺少DNA多聚酶所具有的审阅功能，对于病毒基因组在复制过程中出现的错误不能识别和修复，结果造成发生变异的概率明显升高[5]。2013年3月，上海发现首例人感染H7N9禽流感病例，是全球首次发现人类感染这一亚型禽流感病毒，同月在浙江、江苏等地也相继有病例出现。根据中国疾病预防控制信息系统从2013年4月3日至2015年11月1日的数据，浙江省累计报告人感染H7N9禽流感确诊病例188例，其中死亡病例73例，男女比例约2∶1。本研究对浙江省丽水市首例确诊人感染H7N9禽流感病例标本进行分离鉴定[6]，测定H7N9禽流感病毒人分离株8个基因序列，从分子水平分析其基因特征和遗传变异特点。

1 材料与方法 1.1 标本来源

人感染H7N9禽流感病例咽拭子标本2014年2月8日采集自丽水市流感监测哨点医院流感样病例、有家禽接触史并伴有急性呼吸窘迫综合征入院的患者[6]，经丽水市国家流感监测网络实验室实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测H7N9禽流感病毒核酸阳性和浙江省国家流感参比实验室2014年2月9日复核确诊后获得。咽拭子标本冻存于-152 ℃备用。

1.2 病毒分离

操作要点参考中国疾病预防控制中心制定的《人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》[7]。在P3实验室将H7N9禽流感病毒阳性咽拭子充分振荡、反复挤压后置于4 ℃自然沉淀10 min，取上清液1 ml直接接种于成片的犬肾传代细胞，37 ℃吸附2 h后，置35 ℃、5%CO2培养箱培养，在75%～100%的细胞出现致细胞病变反应(CPE)后反复冻融2次收获病毒，经人O型血红细胞凝集试验(HA)及凝集抑制试验(HI)鉴定后分离到人感染H7N9禽流感病毒株。

1.3 Real-time RT-PCR

扩增H7N9禽流感病毒8个RNA片段的引物见参照文献[8]；病毒液RNA提取用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)试剂盒；RT-PCR用Titan One Tube RT-PCR System Kit(Roche)试剂盒；1.5%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定并切胶纯化[QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)]特异性扩增产物后进行序列双向测定[测通，生工生物工程(上海)股份有限公司]。所有步骤均参照试剂盒说明书和文献[9]方法进行。

1.4 基因分析

生物学软件处理测定的8个RNA序列：ATGC Ver.4和DNAStar Lasergene® 7.1中SeqMan用于序列拼接；BLAST和Clustalx V2.0用于序列多重比对；BioEdit V7.0和GENEDOC用于发现基因位点特征；Mega 6最大似然法(Maximum Likelihood，M-L，bootstrap=1000)用于基因进化分析。本研究中人感染H7N9禽流感病毒各基因序列和其他禽流感病毒参考序列均来源于GISAID和GenBank。

2 结果 2.1 序列测定

P3实验室分离到的人感染H7N9禽流感病毒株命名为：A/Zhejiang/LS01/2014 (H7N9)(LS01株)。基因序列双向测通后经过生物信息学软件拼接获得丽水人感染H7N9禽流感病毒分离株 8个RNA片段核苷酸全序列并递交GenBank(Accession No：KM374039~ KM374046)。

2.2 序列同源性比较

序列多重比对后得到LS01株与其他禽流感病毒株8个基因的同源性数据：血凝素(HA)与A/chicken/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013(H7N9)的同源性为98.9％，NA与A/chicken/Changzhou/C08/2013(H9N9)的同源性为98.6％，其他编码内部蛋白的6个基因均与上海、江苏、山东2013、2014年H9N2株高度同源，见表 1。

表 1 A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)分离株与其他禽流感病毒株8个基因序列同源性比较(%) Table 1 Comparison of nucleotide homology between LS01 strain and other avian influenza virus strain
片段 基因 核苷酸同源性(%) 同源病毒株 长度(bp)
1 PB2 99.5 A/chicken/Rizhao/853/2013(H9N2) 2280
2 PB1 99.1 A/chicken/Shanghai/1107/2013(H9N2) 2274
3 PA 99.6 A/chicken/Rizhao/1339/2013(H9N2) 2151
4 HA 98.9 A/chicken/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013(H7N9) 1683
5 NP 99.7 A/chicken/Rizhao/1339/2013(H9N2) 1497
6 NA 98.6 A/chicken/Changzhou/C08/2013(H9N9) 1398
7 MP 99.3 A/chicken/Shanghai/020/2013(H9N2) 982
8 NS 99.8 A/wildchicken/Shanghai/C1/2014(H9N2) 828
表选项
2.3 分子特性分析

以H3亚型氨基酸顺序为基准分析H7N9 病毒HA编码蛋白的氨基酸位点，LS01株位于HA0蛋白的5个糖基化位点为[10]：30NGTK、46NATE、249NDTV、421NWTR、493NNTY；HA裂解位点为333PEIPKGR*G340[11]；HA蛋白受体结合关键氨基酸位点发生A134T、G186V和Q226L变异[2]。在PB2蛋白上发现对哺乳动物细胞亲和力增加的E627K突变[12]，此外在PB2(271T、701D)和NS1(92D、218~230位缺失)还具有低致病力相关位点。除NP蛋白外在其他蛋白上均发现有病毒毒力在小鼠中增强的相关位点：PB2(L89V)、PB1(I368V、PB1-F2具有完整的90个氨基酸)、HA(D225G)、NA(69～73位的Stalk区缺失)、M1(N30D、T215A)和NS1(P42S)[13, 14]。在M2蛋白上发现抗M2 离子通道阻滞剂金刚烷胺和金刚乙胺耐药位点发生了S31N突变[2]，未发现NA 耐药位点出现神经氨酸酶抑制剂类突变R294K[2]。

2.4 基因进化分析

对LS01株与其他H7N9、H7亚型、N9亚型和北美H7N9禽流感病毒株8个基因核苷酸序列进行基因进化分析，结果显示8个基因均为禽类来源。LS01株HA、NA基因与我国目前流行的特别是沪苏浙一带流行的H7N9禽流感病毒株均位列于同一进化亚分支，有着直接的进化关系(图 1A、1B)；国外与韩国野禽A/wildbird/Korea/A3/2011 (H7N9) 处于较近分支，进化关系最为接近，与北美H7N9禽流感病毒株处于不同分支，进化关系最远。此外，HA基因仍与浙江家鸭A/duck/Zhejiang/2011(H7N3)接近[5]，与H7亚型A/silkiechicken/Wenzhou/796b/2013(H7N7)、A/duck/Wenzhou/771/2013(H7N3)、A/duck/Wenzhou/775/2013(H7N2)有着复杂的进化关系：在相近地域有进化关系较近的禽类(家鸭、鸡、乌骨鸡)流感病毒存在。NA基因与N9亚型A/chicken/Zhejiang/C11/2013(H9N9)、A/chicken/Jiangsu/RD5/2013(H10N9)关系最为接近(图 1)。LS01株HA基因进化最快(参照突变比例，其他6个内部蛋白基因进化树未列出)。

图 1 基于禽流感病毒HA和NA基因核苷酸序列的系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree based on HA and NA nucleotide sequences of avian influenza virus
图选项
3 讨论

丽水禽流感病毒人分离株8个RNA片段核苷酸序列均符合禽源H7N9亚型禽流感病毒特征，未出现较大范围的变异，其病原基因与来源于禽流感病毒浙江鸡H7N9亚型分离株HA基因、常州鸡N9N9亚型分离株NA基因和上海/日照鸡、野鸡H9N2亚型分离株6个内部蛋白基因片段高度同源[2, 3]，该确诊病例流行病学资料记载有明确的家禽宰杀直接接触史，符合哺乳动物中的流感病毒均来源于禽流感病毒的研究推论[5]。

通常认为HA与NA基因在流感病毒的毒力和宿主特异性方面起着重要的作用，尤其是HA中的糖基化位点、受体结合部位以及连接肽氨基酸的替换往往会导致病毒致病性和宿主范围的改变[10, 11, 12, 13, 14, 15]，LS01株HA0蛋白的5个糖基化位点高度保守，HA蛋白受体结合最为重要的关键氨基酸位点发生变异，病毒可能与人类呼吸道上皮细胞唾液酸α-2，6受体位点结合能力增强[3]。LS01株HA裂解位点只包含2个碱性氨基酸K和R，具有低致病性禽流感病毒(LPAIV)基因特点。PB2蛋白包含627K，可在人体中有效行使病毒蛋白合成的功能[12]，在其他蛋白上均有发现病毒毒力在小鼠中增强位点，这些都与病毒对人具有高致病力相关。虽然有证据表明目前丽水以外地区分离到少量的H7N9禽流感病毒已出现耐药位点的突变[5]，但是LS01株对神经氨酸酶抑制剂类药物仍敏感，对金刚烷胺和金刚乙胺耐药。

LS01株HA基因在8个基因中进化最快，与病毒为了通过快速变异来逃避结合中和抗体的报道一致[5]。LS01株与相邻地域存在的来源于H7亚型浙江家鸭、鸡、乌骨鸡分离株以及来源于N9亚型浙江、江苏的鸡分离株进化关系最近，表明LS01株这2个基因还具有较为复杂的进化特点，内部部分基因片段可能是这些病毒的重组体，在感染人之前已经有类似基因片段的毒株在禽类中循环与适应[9]。LS01株与韩国迁徙禽类H7N9分离株的HA和NA基因聚类在相同的进化分支，其他6个基因与国内H9N2禽流感病毒进化关系最为相近，与Gao等[2]、Chen等[3]、Lam等[16]的报道H7 世系与当地不同宿主的 H9N2 病毒至少经过2次重组后产生新型 H7N9病毒，病毒可能通过两种独立的路径从家鸭传递到鸡体内相同。

人感染H7N9禽流感病毒病例大部分是由于患者直接接触了感染该病毒的家禽[2]，己有证据均表明活禽市场是目前人类感染该病毒的主要来源，而禽流感病毒又缺乏严格的宿主感染范围[5]，患者发病前2天有禽类宰杀史，院子里同批宰杀已掩埋的鸡粪便标本检测结果为禽流感H7N9病毒核酸阳性[6]，但是由于标本污染严重，并未分离到病毒和进行基因序列测定，无法进一步溯源。此外，笔者在本地鸡肺脏、粪便标本和农贸市场外环境标本中均检出H7N9禽流感病毒[17]，因此与感染病毒的家禽或不明原因病死的家禽密切接触人员是高危人群，而各年龄段的人群均具有易感性，H7N9禽流感病毒在不同宿主动物体内增殖、重配继而导致多宿主感染的可能性是存在的[18]。

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