2013年3月，我国报道首例人感染H7N9禽流感病例，进化分析表明H7N9病毒的基因均属于禽源，HA基因与类A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)最为接近，NA基因与A/wild bird/Korea/A14/2011(H7N9)最为接近，其余内部基因与A/Brambling/Beijing/16/2012(H9N2)病毒最为接近^{[1, 2]}。由于H7N9禽流感病毒HA基因裂解位点处缺少多个碱性氨基酸裂解位点，表现为对禽类低致病性。HA基因Q226L突变、PB2基因E627K突变等各基因特点表明其该病毒具有结合人受体及在哺乳动物间进行传播的潜在能力^[3]。

流感病毒血清学检测在流行病学调查和病例诊断方面均具有重要意义，现有血清学方法主要包括血凝抑制实验(Haemagglutinin inhibition，HI)、微量中和实验(Micro neutralization，MN)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和Western blot等方法，不同方法各有优势和不足。文献报道确定H5N1禽流感病毒感染时，需要多种血清学方法相结合来确定H5N1抗体滴度^[4]。H7N9禽流感病毒的血清学检测多采用简便的HI方法，2013年45月浙江省禽流感相关职业暴露人群血清中H7N9 抗体滴度≥80，所占比例为6.3%； H7N9抗体滴度≥160，所占比例为1.3%^[5]，2013年512月深圳职业人群中血清中H7N9 抗体阳性率为7.2%~14.9%^[6]，不同地区H7N9抗体水平的差异不能排除检测方法本身所导致的阳性率误差。本研究组在前期优化了H7N9禽流感病毒MN方法和Western blot检测的基础上^[7]，在此建立了微量空斑减少方法(mMicro-plaque reduction assay，MPR)用于测定H7N9禽流感病例血清中和抗体的滴度，并与优化后的MN方法进行对比，证实该方法具有良好的灵敏度和特异性，能够作为H7N9禽流感中和抗体检测方法。

人感染H7N9禽流感病毒分离株A/Anhui/1/2013(H7N9)和MDCK细胞由国家流感中心保存。

抗A/Anhui/1/2013(H7N9)雪貂血清由国家流感中心制备，不同亚型的流感病毒抗体阳性血清(HI>40)由国家流感中心收集并保存，其中包括15份H5N1、49份H9N2、94 份甲型流感H1N1和100份季节性流感抗体阳性血清(每份血清中均含有抗H3N2、H1N1、B/Victoria、B/Yamagata四种抗体)。鼠抗流感病毒NP抗体和羊抗小鼠IgG-HRP抗体购自KPL公司。

微晶纤维素购自上海昌为公司，货号RC591；True Blue^TM peroxidase substrate，0.03% H₂O₂和显色液购于KPL公司; RDE购自日本Denka-seiken公司。

96孔板每孔加入MDCK细胞 2×10⁵/200 μl，培养温度37 ℃，5% CO₂，培养72 h，弃去孔内生长液，加入200 μl PBS洗涤细胞3次。将病毒依次进行10倍稀释，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，将每个稀释度的病毒取50 μl，加入96孔板中，37 ℃，孵育2 h后，每孔加入 200 μl微晶纤维素，37 ℃，过夜。吸去微晶纤维素，加入预冷的4%多聚甲醛溶液，每孔200 μl，4 ℃，30 min。弃去多聚甲醛，每孔加入100 μl 洗液(含0.05% Tween -80 PBS) 洗涤2次。每孔加入100 μl 渗透液(含0.2% TritonX-100 PBS)，室温30 min。弃去渗透液，每孔加入100 μl 洗液洗涤2次。每孔加入 50 μl一抗，室温孵育1 h，每孔加入100 μl 洗液洗涤3次，每次5 min。每孔加入50 μl二抗，室温孵育1 h，每孔加入100 μl 洗液洗涤3次，每次5 min。弃去洗液，每孔加入50 μl显色液，室温静止30 min进行显色，每孔加入蒸馏水300 μl，室温孵育2~3 min，洗涤2次。弃去蒸馏水，计数病毒形成空斑的数目。

96孔板每孔加入MDCK细胞2×10⁵/200 μl，培养温度37 ℃，5% CO₂，培养72 h，细胞汇合后，每孔加入50 μl病毒液，设立病毒对照和细胞对照复孔。将RDE处理后的待检血清依次进行1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640稀释，每孔加入50 μl稀释后的抗体，37 ℃，孵育2 h，每孔加入200 μl微晶纤维素，37 ℃过夜，按病毒滴定方法中的固定和染色方法进行操作，确定待检抗体的中和活性。空斑数目减少50%~80%之间的稀释度为抗体的中和滴度^[8]。

法 通过调整MN方法中试剂的浓度优化MN方法，具体方法参见文献^[3]。

具体方法参见文献^[4]。

采用MPR方法分别检测H5N1、H9N2禽流感病毒抗体阳性人群血清、甲型H1N1抗体阳性血清及季节性流感病毒抗体含有抗H1N1、H3N2、B/Victoria和B/Yamagata 4种季节性流感病毒抗体阳性人群血清中的抗A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒抗体滴度。设立抗A/Anhui/1/2013(H7N9)雪貂血清作为阳性对照血清，进行特异性验证。同时利用MN方法和HI方法对上述血清进行平行检测。结果显示，MPR方法测定所有上述人群中抗H7N9抗体滴度均 <1：10；MN方法和HI方法测定所有上述人群中抗H7N9抗体滴度也均 <1：10，3种方法测定上述血清中抗H7N9禽流感抗体均为阴性，同时设立抗H7N9阳性对照血清，抗体滴度≥1：320，表明MPR方法检测H7N9中和抗体具有良好的特异性。

采用MPR方法、优化的MN方法和HI方法共同测定15份H7N9病例恢复期(≥21 d)血清中H7N9中和抗体滴度。15份H7N9病例恢复期血清的采血时间、病例的年龄、性别、发病时间及检测结果见表 1。

综合上述灵敏度和特异度结果，以既往优化并验证的MN方法检测结果为标准^[7]，以MN方法检测临界值≥20为阳性判定标准，使用MPR方法检测其他亚型流感病毒抗体阳性血清以及检测15例H7N9病例血清的检测结果均与MN方法一致，灵敏度和特异度均为100%。

人感染新发禽流感病毒的血清学检测一直是难点，一方面由于禽流感病毒激发的人体免疫反应往往偏低，另一方面因为难以确定新发禽流感病毒的血清学结果判断标准，来实现最佳的检测灵敏度和特异性。2003年荷兰H7N7禽流感暴发造成感染人群对该亚型流感病毒免疫原性弱，影响血清学诊断^[9]。既往H5禽流感感染病例的血清学诊断方法采用HI、MN和Western blot等多种方法联合使用，确定血清抗体滴度的临界值，作为感染病例和无症状隐性感染人群血清学诊断标准^[10]。2013年，全球首次报道了人感染H7N9 禽流感病例^[2]，部分感染者产生抗体滴度较低及不同血清学检测方法的差异，对H7N9血清学诊断标准提出了挑战。H7N9病毒出现后 ，笔者采用HI方法或者MN方法，进行血清中抗体水平的测定。为了提高血清学检测的灵敏度和特异度，曾分别使用HI方法和优化后的MN方法，确定HI方法检测抗体临界值为HI≥160，MN方法检测抗体临界值为MN≥20，作为感染后血清抗体阳性判断标准^[3]。本研究中以单独的HI方法检测病例血清，以HI≥160作为阳性判定标准，则有一例病例不能被检出，检测的灵敏度下降。而MN方法和MPR方法同时进行检测，该病例均能被检出，本研究建立的MPR方法与MN方法相比，用于检测病例血清中H7N9抗体具有相似的灵敏度和特异性。MPR方法将待测血清与病毒结合后，未结合病毒感染MDCK细胞产生空斑数目下降50%~80%，以此确定抗体滴度，该方法对流感病毒在MDCK细胞上的生长性要求不高。而MN方法以血清结合病毒后，未结合病毒感染MDCK细胞后产生的细胞病变确定抗体滴度，MN方法要求病毒量达到100 TCID₅₀，相比MPR方法，MN方法对病毒在MDCK细胞的生长性具有一定要求。因此MPR方法与MN方法相比，更适合检测新亚型流感病毒抗血清和细胞生长性较差的季节性流感病毒如H3N2人群血清的测定。

空斑减少方法是通过病毒感染细胞时会导致细胞的死亡扩散时与细胞之间进行直接接触，在单层细胞之间形成空斑，而加入抗体则能够中和病毒减少空斑形成，进而测定抗体效价。空斑实验是经典的病毒学方法，由于其直观性，同时可以排除ELISA等抗体检测中其他因素的干扰，被认为是血清检测方法中的最可信的方法^[4]。目前空斑减少方法已广泛用于天花病毒抗体以及麻疹病毒抗体等多种病毒抗体的检测。MPR方法可以实现仪器自动读取空斑，方便性优于传统的空斑实验^[8]。本研究建立了MPR方法进行血清中H7N9禽流感病毒抗体检测，具有良好的特异度和灵敏度，同时由于该方法适合少数病例诊断和鉴别诊断，不适合标本量大的血清检测，MPR方法为H7N9血清学诊断提供了新的技术方法和手段。