小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)是引起国际社会广泛关注的一种新发食源性致病菌^[1]，鼠作为耶尔森菌属重要的宿主，具有分布广泛，活动性强等特点。人感染小肠结肠炎耶尔森菌后，主要表现为胃肠道症状，如呕吐、腹痛、腹泻等，多具有自限性。但部分患者可能出现一系列严重的并发症，除引起胃肠道症状外，还可能引起呼吸系统、心血管系统、骨骼结缔组织等疾病，甚至可引起败血症，造成死亡^{[2, 3, 4]}。

国外一些学者认为，小肠结肠炎耶尔森菌能阻止鼠疫的传播，第三次世界鼠疫大流行期间，日本、欧洲动物间的小肠结肠炎菌感染较高，阻止了鼠疫菌的传播。在我国甘宁黄土高原鼠疫疫源地家鼠和农家周边的野鼠小肠结肠炎菌携带率很高，因此阻止了鼠疫的流行，而内蒙古高原鼠疫疫源地中家、野鼠小肠结肠炎和假结核菌的携带率都很低，因而未能阻止鼠疫流行^{[5, 6]}。

云南省作为第三次世界鼠疫大流行的起源地，近年来鼠疫流行处于静息期，鼠疫耶尔森菌分离率很低，有研究表明云南省鼠疫自然疫源地存在小肠结肠炎耶尔森菌，探索云南省鼠疫菌与小肠结肠炎耶尔森菌之间的关系，对云南省小肠结肠炎耶尔森菌的监测已成为迫切要求^[7]。本文在2013-2014年期间对剑川县野鼠鼠疫疫源地进行小肠结肠炎耶尔森菌分布情况调查分析，现报告如下。

2013年5月至2014年4月间，从云南省剑川县的8乡镇(剑川石龙、剑川马登、剑川弥沙、剑川上兰、剑川双河、剑川下河、剑川象图、剑川羊岑)采集鼠类盲结肠标本645份，其中大绒鼠345份、齐氏姬鼠198份、小林姬鼠39份、中华林姬鼠23份、贝氏树鼩12份、褐家鼠7份、中华姬鼠5份、灰麝鼩4份、黄鼬和巢鼠各3份、长尾鼩鼱2份、白腹松鼠、白腹鼠、侧纹岩松鼠和大足鼠各1份。

本研究所用的主要试剂：小肠结肠炎耶尔森菌选择性培养基(OXOID，Yersinia selective agar base)、改良磷酸盐缓冲液(PBS)(Fluka，peptone sorbitol bile broth)、Api20E生化鉴定条(法国生物梅里埃公司)、聚合酶链反应(PCR)所有试剂(上海生物工)以及DNA提取试剂盒(天根生化科技)，试剂均在有效期内使用。

生物安全柜(Nuair)，PCR扩增仪(Bioertra)，PCR直流电泳槽及模具(DYY-C6型，北京六一仪器厂)，凝胶成像仪(Syngene)，高速离心机(Bechman)，恒温水浴锅，25 ℃/37 ℃恒温培养箱。

采集鼠类盲肠、结肠标本置于事先预备好的10 ml改良PBS培养基中，送达实验室进行冷增菌，于-4 ℃冷增菌20 d，接种于耶尔森菌选择性培养基，即CIN培养基，在25 ℃培养24 h，观察菌落特征。经25 ℃，24～48 h培养后，观察并挑选可疑菌落(边缘透明，边界清晰，中心深红色，成“公牛眼”状菌落)做进一步鉴定。

挑取适量上述可疑菌落对其进行foxA、ail及inv基因的菌落PCR初筛。PCR反应体系配置：premix 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，纯水10.5 μl。扩增参数：95 ℃预变性5 min，按 94 ℃变性15 s、57 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，扩增25个循环，72 ℃延伸5 min。扩增结束后于1.5%琼脂糖凝胶(加入Goldview染料，浓度为5 μl /100 ml)电泳，在紫外灯下获取结果，引物及扩增条件见表 1。单独foxA阳性初步判定为小肠结肠炎耶尔森菌，foxA与ail皆阳性初步判定为致病性小肠结肠炎耶尔森菌，而inv阳性则判定为假结核耶尔森菌。

将上述菌落PCR筛选阳性菌株25 ℃培养箱培养24 h后，再接种于新的耶尔森选择性培养基平板25 ℃培养17 h后，用接种针挑起菌落至悬浮基物中，仔细研匀以达到均一的细菌悬液，参照API 20E肠杆菌鉴定系统说明书接种于试剂条，在37 ℃恒温培养箱中培养18~24 h后判读结果。

将645标本进行菌落PCR扩增，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，有52份标本为foxA阳性，为小肠结肠炎耶尔森菌；且有1株标本检测到两条目的条带：foxA(+)、ail(+)，为致病性小肠结肠炎耶尔森菌。

将PCR筛选的52株菌株标本通过API 20E生化鉴定条鉴定，共有34株为小肠结肠炎耶尔森菌，9株为费氏克氏耶尔森菌，2株为产酸克雷伯菌，2株为克氏耶尔森菌，1株为肺炎克雷伯菌。

结合菌落PCR和生化鉴定从剑川鼠盲肠、结肠645份标本分离到34株小肠结肠炎耶尔森菌，分离率为5.27%(34/645)，分离的鼠类标本分别是大绒鼠、贝氏树鼩、褐家鼠、齐氏姬鼠、小林姬鼠。由图 1可知，34株小肠结肠炎分离鼠种数由高到低依次为：大绒鼠、齐氏姬鼠、小林姬鼠、贝氏树鼩、褐家鼠；大绒鼠采集率最高，其次为齐氏姬鼠。

图 1 剑川县645份标本与34株小肠结肠炎标本分离比较对比 Figure 1 To contrast 645 specimens and 34 strains Yersinia enterocolitica from kind of specimens rat in Jianchuan

图选项

34株小肠结肠炎分离自剑川 8个乡镇(剑川石龙、剑川马登、剑川弥沙、剑川上兰、剑川双河、剑川下河、剑川象图、剑川羊岑)，其中，分离率最高是剑川马登(15.63%)，其次是剑川石龙(10.08%)，详见表 2。

剑川县野鼠鼠疫自然疫源地鼠盲肠、结肠645份标本的调查仅分离到34株小肠结肠炎耶尔森菌，所有标本的总分离率为5.27％，大绒鼠、贝氏树鼩、褐家鼠、齐氏姬鼠、小林姬鼠的检出率分别为2.97%、0.16%、0.16%、1.55%、0.61%，大绒鼠检出率最高(表 3)。结合图 1，大绒鼠采集率和检出率最高，其次为齐氏姬鼠。相关资料表明，剑川县野鼠鼠疫疫源地检出鼠疫菌的标本也是绒鼠(31%)和姬鼠(25%)占有比例大，这可能与这两种鼠种为剑川县野鼠疫源地常见鼠种有关，也可能是剑川县野鼠鼠疫自然疫源地小肠结肠炎耶尔森菌的重要宿主动物，是本地区动物与人群感染流行的潜在传染源；都需要做进一步的研究，为今后监测和预防控制该病原菌在宿主动物间流行引起人群感染提供科学依据。

耶尔森菌属包含11个菌种，对人致病的菌种有小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌及鼠疫耶尔森菌^[8]。3种致病性耶尔森菌之间是否存在相互拮抗作用，是目前鼠疫的静息研究中较为突出的问题^[9]。潘珠等^[10]研究表明耶尔森菌在试管内表现出拮抗作用，主要有三方面的原因：第一，可能与细菌本身生长繁殖速度快慢有关；第二，可能与它们之间具有相同的45MD质粒和质粒所控制的Vw毒力因子及部分共同抗原有关，张曼碧等^[11]曾有论述，全菌抗原与全菌产生的抗体有一定的相关性；第三，可能与菌株的毒力强弱有关。

鼠疫静息多年后，鼠疫菌在免疫机体和自然噬菌体的作用下形成弱毒并非罕见^[10]。弱毒鼠疫菌可能较长时间在自然界存在或动物间传播，而3种致病性耶尔森菌之间存在相互拮抗作用，当区域内其中一种耶尔森菌在自然界或动物中占优势，动物感染率高，产生抗体动物数偏多，就有可能抑制另一种耶尔森菌的再感染，因而能够阻止另一种耶尔森菌的扩散流行^[10]。

通过本实验分离鉴定，34株检出菌均是小肠结肠炎耶尔森菌，未检出假结核耶尔森菌及鼠疫耶尔森菌，相关文献证实剑川是野鼠疫源地的老疫区，特别是剑川石龙和马登，是鼠疫源地的常规监测点，近6年未检出鼠疫菌^{[12, 13, 14]}；这两个地方的小肠结肠炎耶尔森菌检出率高于其他地方，而且菌种在同一疫源地的分布不存在重叠，在一定程度上可以推测这3种菌之间可能存在拮抗或替代关系，在剑川是否存在此现象，在自然界是否能与实验室现象互证，仍需做进一步的研究。如果上述关系成立，则有助于笔者评估鼠疫疫源地鼠疫暴发的潜在危险性。