恙虫病(Tsutsugamushi disease)又称丛林斑疹伤寒(Scrub typhus)，是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi，Ot；原称恙虫病立克次体，Rickettsial tsutsugamushi)感染引起的一种自然疫源性疾病，鼠类为主要传染源，经恙螨叮咬而传播给人类^{[1, 2]}。主要临床特征为突发高热、虫咬处溃疡或焦痂、淋巴结肿大、皮疹以及多器官损害，严重者可致死亡^{[2, 3]}。近年来，恙虫病在许多国家和地区再度发病，特别在亚太地区流行十分广泛^{[4, 5]}。随着一些Ot新型株和耐药菌株的不断出现以及当前生态旅游的盛行，一些高发地区在没有应用抗生素的情况下其病死率可高达50%，目前已成为世界性关注的疾病^{[3, 6]}。我国恙虫病的流行形势较为严重，特别是近年该病的流行范围不断扩大，病例数呈现上升趋势，一些省区还发现了大量的新型Ot 株^{[7, 8, 9]}。云南为我国西南边陲省份，是我国恙虫病流行的主要省份^[10]。近些年云南省恙虫病暴发疫情较为频发，并有死亡病例出现^{[11, 12, 13]}，虽然有经血清学证实的病例报告，但缺乏病原学方面的证据，而且恙虫病流行病学调查的资料几乎为空白。为此，笔者采用分子生物学方法于2010-2013年对云南地区鼠类和人自然感染Ot状况进行调查。

2010-2013年，在云南省玉溪、德宏、红河、保山、昆明和大理居民区和山地采用鼠夹和鼠笼诱捕法捕鼠，现场无菌解剖取鼠类内脏，置液氮保存。收集医疗机构送检的大理地区不明原因发热患者血液23份，分离出血清置-20 ℃保存。

以生理盐水作为研磨液将鼠脾脏及人血清分别用乳钵进行研磨。取60 μl鼠脾脏悬液，采用Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒 (Promega公司)，按说明书操作。

应用文献[14]中的引物及条件对Ot 56 kDa蛋白基因(sta56)进行扩增，引物由上海生工公司合成。PCR反应总体积为25 μl，应用Promega公司GoTaqGreen Master Mix (2×)试剂盒在Biometra TProfessional PCR仪中进行二次PCR扩增，以无菌水作为阴性对照，无阳性对照。第一次扩增时取6 μl被检标本DNA作为模板，第二次扩增时取第一次扩增产物1 μl作为模板。取二次PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶检测，DNA标准为DL2000，加样量5 μl/孔，预期能扩增出目的片段大小150~168 bp。

PCR阳性产物送上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。将所得到的序列通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)后，利用Blast工具以及采用DNAStar中的MegAlign软件对序列进行同源性比较，运用Mega 6.06软件Neighbor-joining法(Bootstrap值设定为1000)构建系统进化树。

共捕获小型哺乳动物7属11种485只，其中黄胸鼠占45.57%、褐家鼠占24.33%、大绒鼠占20.62%，黄胸鼠为优势鼠种，见表 1。

共检测鼠脾脏485份，结果扩增出Ot sta56基因片段2份，分别为大绒鼠HHSP65、高山姬鼠HHSP112，阳性率0.41%，见表 1和图 1。共检测不明原因发热病例血清23份，结果扩增出Ot sta56基因片段1份，为DLRX9，阳性率4.35%。

注： M：DL2000 DNA Marker; 1：HHSP61;2：HHSP62; 3：HHSP63; 4：HHSP64; 5：HHSP65; 6：HHSP66; 7：HHSP67; 8：HHSP68; 9：HHSP69; 10：HHSP70; N：Negative control 图 1 nPCR扩增Ot sta56片段部分结果 Figure 1 Results of amplification of partial Ot sta 56 segment with nPCR-2013

图选项

根据Ot sta56基因部分序列应用MegAlign软件将测序获得的样本序列与GenBank中已知参考菌株序列进行同源性比较，结果序列HHSP65和HHSP112的同源性100%。

序列HHSP65(152 bp)与中国台湾TT0711a株的同源性最高为89.6%，与中国台湾Hualien-1和NT0711a株的同源性均为86.3%，与中国安徽JF704210株的同源性为73.1%，与Kawasaki、Karp株的同源性分别为79.7%和73.1%。

序列DLRX9(171 bp)与泰国PG9和Li3b株、中国浙江Jin/2012株的同源性均为98.4%，与Karp、Taiwan(Gilliam型)、Kawasaki株的同源性分别为81.9%、76.9%和65.4%。

序列DLRX9与HHSP65株的同源性64.8%，序列TT0711a与Kawasaki株的同源性80.8%。

根据Ot sta56基因部分序列进行系统进化树分析，样本DLRX9与泰国PG9和Li3b及安徽Jin/2012等株在同一分支上，表明本次检测到的DLRX9株与一些泰国株的遗传进化关系较为密切，DLRX9株为Karp基因型；而序列HHSP65与TT0711a株不在同一分支，表明本次检测到的HHSP65株与TT0711a的遗传进化关系较远，见图 2。

图 2 根据Ot sta56基因部分序列构建的系统进化树 Figure 2 Phylogenetic tree constructed based on partial Ot sta56 gene

图选项

云南为我国西南边陲高原山区省份，与缅甸、老挝、越南接壤，北回归线从该省南部横穿而过，以热带和亚热带气候为主，地理环境复杂多样，素有“动植物王国” 之称。该省优越的自然条件蕴育着小型兽类200多种、恙螨190 余种，宿主动物及媒介十分丰富^{[15, 16]}，致使当地存在多种自然疫源性疾病。近年来，云南省立克次体病疫情较为频发，2002年东川暴发恙虫病^[11]、2004年大理暴发鼠型斑疹伤寒^[17]、2005年大理暴发恙虫病^[12]、2009年保山暴发鼠型斑疹伤寒^[18]、2010年瑞丽暴发鼠型斑疹伤寒^[19]、2013年峨山暴发恙虫病^[13]。目前，云南省恙虫病病例的报告屡见不鲜^{[20, 21]}，但是更多的仅停留在临床诊断病例，病原学方面的直接证据较为缺乏。本次研究应用分子生物学方法对云南地区鼠类和不明原因发热患者自然感染Ot的情况进行了调查，结果显示鼠的感染率为0.41%，发热患者的感染率为4.35%，为进一步对该省进行恙虫病自然疫源地调查提供了病原学方面的线索和依据。

Ot 抗原型别复杂多样，以往研究证实我国Ot血清型以Gilliam型为主，其次Karp型，Kato型和混合型较少见^[10]，而云南省以Karp型多见，其次Gillian型，Kato型和混合型罕见^[22]。本次研究通过对Ot基因sta56检测及同源性分析发现DLRX9与HHSP65株的同源性为64.8%，进化树分析显示两者亲缘遗传进化关系较远，提示两者为2种不同的基因型别Ot株，表明云南省Ot抗原型别可能呈现多样化。序列分析显示DLRX9与Karp基因型泰国PG9和Li3b、中国浙江Jin/2012等株的同源性最高均为98.4%，与Karp株的同源性为81.9%，进化树分析显示DLRX9与PG9、Li3b、Jin/2012株在同一分支上，表明本次检测到的DLRX9株的基因型为Karp型。HHSP65与中国台湾TT0711a株的同源性最高为89.6%，与中国台湾Hualien-1和NT0711a株的同源性均为86.3%，与日本Kawasaki株的同源性为79.7%，进化树分析显示HHSP65与TT0711a株不在同一分支上，表明本次检测到的HHS65株为Ot新型株。曾有研究显示中国台湾TT0711a和NT0711a株基因型均为Kawasaki型^[23]，提示本次检测到的HHSP65株基因型可能与日本Kawasaki株密切相关。本次研究首次从病原学方面证实了云南地区不仅存在Karp基因型Ot，而且还存在新型Ot，该新型Ot可能为日本Kawasaki类似株。这是首次证实云南省可能存在日本Kawasaki类似株，为进一步研究或自然疫源地调查提供了一定的病原学证据或研究线索。

本次研究初步证实云南省存在两种恙虫病病原体，病原体存在差异其毒力也会不尽相同，致使云南省恙虫病患者的临床表现和症状多样化，从而增加了临床医务工作者的识别与诊断难度。云南省为我国旅游胜地，自然环境优越，物种极其丰富，鼠类和恙螨繁多。因此，为了加强云南省恙虫病预防与控制，开展Ot病原学方面的研究工作具有重要现实意义。