疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (5): 380-386

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王怡婷, 金东, 杨晶, 卢珊, 濮吉, 孟祥莉, 张桂, 徐建国
WANG Yi-ting, JIN Dong, YANG Jing, LU Shan, PU Ji, MENG Xiang-li, ZHANG Gui, XU Jian-guo
喜马拉雅旱獭源鹑鸡肠球菌的分离及其耐药性检测
Isolation and antibiotic resistance detection of Enterococcus gallinarums from Marmota himalayana
疾病监测, 2016, 31(5): 380-386
Disease Surveillance, 2016, 31(5): 380-386
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.05.008

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收稿日期：2016-03-08
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王怡婷, 金东, 杨晶, 卢珊, 濮吉, 孟祥莉, 张桂, 徐建国. 喜马拉雅旱獭源鹑鸡肠球菌的分离及其耐药性检测[J]. 疾病监测, 2016, 31(5): 380-386.
WANG Yi-ting, JIN Dong, YANG Jing, LU Shan, PU Ji, MENG Xiang-li, ZHANG Gui, XU Jian-guo. Isolation and antibiotic resistance detection of Enterococcus gallinarums from Marmota himalayana[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(5): 380-386.
喜马拉雅旱獭源鹑鸡肠球菌的分离及其耐药性检测
王怡婷, 金东, 杨晶, 卢珊, 濮吉, 孟祥莉, 张桂, 徐建国     
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206
收稿日期: 2016-03-08
基金项目: 国家自然科学基金重大项目(No.81290340,81290345)
作者简介: 王怡婷,女,甘肃省兰州市人,硕士,主要从事传染病预防控制研究
作者贡献: 徐建国：提供文章思路，设计论文框架；修订论文；终审论文
王怡婷：调研整理文献；文章初稿的撰写、进行实验
金东、杨晶：修订论文
卢珊、濮吉：样本采集
孟祥莉、张桂：实验辅助
通信作者: 徐建国,Tel:010-58900749,Email:xujianguo@icdc.cn.
摘要: 目的 了解青藏高原喜马拉雅旱獭携带院内感染病原菌鹑鸡肠球菌情况,并检测其对临床常用抗菌药物的耐药性。 方法 选择性培养基、革兰染色、生化反应和16S rRNA基因序列分析方法对细菌进行分离和鉴定;K-B纸片法检测菌株对15种抗菌药物的耐药情况,并应用PCR方法检测毒力基因和耐药基因。 结果 79份喜马拉雅旱獭肠道样本中共分离到3株鹑鸡肠球菌,其中1株对利福平中介,3株均对奎奴普丁中介,对其他被检抗菌药物均敏感;未检测到常见肠球菌毒力基因(asa1、esp、hyl、gelE和cylA)和相关耐药基因。 结论 首次在青藏高原旱獭粪便中分离到鹑鸡肠球菌,常见的毒力基因检测阴性,对常见抗菌药物敏感。
关键词： 喜马拉雅旱獭     鹑鸡肠球菌     耐药性     毒力基因    
Isolation and antibiotic resistance detection of Enterococcus gallinarums from Marmota himalayana
WANG Yi-ting, JIN Dong, YANG Jing, LU Shan, PU Ji, MENG Xiang-li, ZHANG Gui, XU Jian-guo     
State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control, Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract: Objective To understand whether Marmota himalayana is a possible carrier of Enterococcus gallinarum, one of the emerging pathogens for hospital related infections. Methods Selective medium culture, biochemical reaction and 16S rRNA sequencing were conducted for the isolation and identification of isolated strains, K-B test was done to detect the drug susceptibility of isolated strains, and PCR amplification of virulence genes were performed. Methods Three strains of E. gallinarum were isolated from intestinal samples of 79 Marmota himalayana captured in Qinghai-Tibet Plateau in Qinghai province, which were identified by both biochemical tests and 16S rRNA gene sequence analysis. The drug susceptibility test using 15 common antibiotics indicated that 3 isolates were all sensitive to 13 antibiotics, but intermediate to quinupristin, and 1 isolate was intermediate to rifampin. And none of 5 recognized virulence genes in genus of Enterococcus was detected in the 3 isolates, i.e. asa1, esp, hyl, gelE and cylA. Conclusion In contrast to other studies, we isolated 3 antibiotics sensitive and virulence-gene-free E. gallinarum strains from Marmota himalayana for the first time.
Key words: Marmota himalayana     Enterococcus gallinarum     Drug resistance     Virulence gene    

鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)1984年首次从鸡粪便样本中分离得到，可引起人类感染，包括尿路感染、腹腔感染以及败血症、伤口感染、心内膜炎和脑膜炎等[1-2]。近年来研究发现，鹑鸡肠球菌对多种抗菌药物的耐药性呈上升趋势[3]。耐万古霉素鹑鸡肠球菌甚至可引起院内感染暴发。我国不同地区均可见关于鹑鸡肠球菌感染病例的报道，尤其多见于医院院内感染病例[4-6]。根据中国CHINET细菌耐药性监测网报道，2011年全国15所医院共计分离到102株鹑鸡肠球菌，分离率为2.2%，对万古霉素耐药率为82.7％，对磷霉素、氯霉素的耐药率分别为13.6％和7.5％，但对替考拉宁、利奈唑胺高度敏感[3]。

国外研究显示，鹑鸡肠球菌在多种野生动物的分离率较高，其中红鸠 71.2%，白鹳 46.9%，红腿鸽7.9%，野熊 4.9%。大多数鹑鸡肠球菌对四环素(66.3%)和红霉素(46.1%)耐药，对卡那霉素、庆大霉素、链霉素的耐药率分别为22.9%、9.4%和11.5%[7]。我国科学家从猪及禽类动物中也分离到鹑鸡肠球菌[8-9]。本研究从青藏高原捕获的79只喜马拉雅旱獭中分离鹑鸡肠球菌，并对其药物敏感性、耐药基因和常见毒力基因进行检测，以了解我国青藏高原喜马拉雅旱獭携带鹑鸡肠球菌的药物敏感性和致病性状况。

1 材料与方法 1.1 标本采集

2013年78月在青海省玉树地区(N33°，E96°)采集标本。主要为国家动物鼠疫监测项目中捕获的喜马拉雅旱獭，鼠疫菌检测阴性，取其大肠肠段及肠内容物标本，置30%甘油保菌液的5 ml灭菌医用采样管中，立即冻存于低温冰箱，运输至本实验室，-80 ℃低温保存。

1.2 菌株分离与鉴定 1.2.1 菌株分离

用无菌接种环蘸取少许旱獭粪便，三区划线接种于K-F链球菌选择性培养基，36 ℃、5%CO2孵箱培养48 h。挑取可疑单菌落，划线接种于哥伦比亚血平板，相同条件下进行纯化培养。纯培养物保存于含20%甘油的脑心浸液保菌液中，-80 ℃冰箱冻存。

1.2.2 生化鉴定

使用法国生物梅里埃公司的API 20 Strep生化试剂条完成生化鉴定。挑取经纯化后的单菌落制成菌悬液并接种于API 20 Strep试剂条，培养24 h后根据实验说明加入指示剂，根据说明书判读反应，用apiweb 1.1.0软件鉴定试验结果。

1.2.3 细菌16S

rRNA基因扩增、测序和分析 菌株核酸用全基因组核酸提取试剂盒(Genomic DNA purification kit，Promega)提取，步骤按说明书进行。16S rRNA基因PCR扩增体系为：10×rTaq PCR Buffer 5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μl，TaKaRa exTaq 0.5 μl，模板DNA(≤100 ng/μl)2 μl，上下游引物27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG；1492R：ACG GYT ACC TTY TTA CGA CTT各1 μl[10]，无菌去离子水补至50 μl。扩增参数：94 ℃，预变性5 min，94 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃后延伸10 min。

用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的条带单一且大小与预期一致者，切胶回收。使用胶回收试剂盒(QIAquick Gel extraction kit，Qiagen)纯化PCR产物后，进行16S rRNA基因T-A克隆。使用pGEMT-EASY载体；热激转化大肠埃希菌JM109感受态细胞。复苏1 h后涂布LB氨苄抗性平板(表面涂布X-gal和IPTG)；37 ℃孵箱培养过夜，挑取白斑，提取质粒并进行双向测序；测序结果用DNAStar 7.1软件拼接及NCBI网站在线去除载体序列，最终获得16S基因序列于NCBI网站用BLAST进行在线比对。

利用Mega 5.1软件对分离的 3株鹑鸡肠球菌以及52株肠球菌属参考菌株的16S rRNA 基因序列进行分析，构建Neighbor-joining(NJ)系统进化树后，用bootstrapping法重复500次检验系统进化树上的分支点并删除<50的分支。

1.2.4 药敏试验

药敏纸片(Antimicrobio Susceptibility Test Discs，OXOID)及MH琼脂(MuellerHinton Agar，OXOID)、抗菌药物种类详见表 4。药敏试验根据美国临床试验室标准委员会(CLSI)推荐的K-B(Kirby-Bauer)纸片法进行，用一次性采样棉拭子在血平板上挑取纯化好的单个菌落，悬于2 ml生理盐水中以制成比浊度为0.5麦氏单位的菌悬液；用一次性采样棉拭子蘸取调制好的菌悬液，挤去多余菌液，在MH琼脂平板上分3次均匀涂抹，每次涂抹好后转60°再次涂抹，最后在边缘转2圈以确保均匀涂布；放置3~5 min，待表面水分吸干后，用药敏纸片分配器将药敏纸片贴于平板上，37 ℃培养16~18 h后读取抑菌环直径。以粪肠球菌ATCC51299、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212为质控菌株，参照CLSI 2015标准判读结果[11]。

1.2.5 耐药基因检测

采用PCR方法检测青霉素类耐药相关基因pbp5C、pbp5N；万古霉素耐药相关基因vanA、vanB、vanC1及vanC2；红霉素耐药相关基因ermA、ermB和ermC；四环素类耐药相关基因tetW和tetM；喹诺酮类抗生素耐药相关基因gyrA和parC；磷霉素类耐药相关基因fosA、fosB和fosC；奎奴普丁耐药相关钝化酶基因vatA、vatB、vatC、vatD和vatE；奎奴普丁耐药外排相关基因lsaE、msrC、vgaA和vgaB；链阳酶素失活酶编码相关的vgbA、vgbB基因。耐药基因引物及PCR扩增条件见表 1。

表 1 常见肠球菌属耐药基因引物及PCR条件 Table 1 Primers and PCR conditions for detection of drug resistance genes of Enterococcus
基因名 引物序列(5′~3′) 退火温度(℃) 产物大小(bp) 参考文献
pbp5C F：AAC AAA ATG ACA AAC GGG 54 779 [12]
R：TAT CCT TGG TTA TCA GGG
pbp5C F：AAA AAT CGA ACA ACA GGC GCT TA 54 1164 [13]
R：TTG TGA GATC CCG TTT GTC A
vanA F：GGG AAA ACG ACA ATT GC 55 732 [14]
R：GTA CAA TGC GGC CGT TA
vanB F：ATG GGA AGC CGA TAG TC 55 635 [14]
R：GAT TTC GTT CCT CGA CC
vanC1 F：GAA AGA CAA CAG GAA GAC CGC 54 796 [15]
R：ATC GCA TCA CAA GCA CCA ATC
vanC2 F：CGG GGA AGA TGG CAG TAT 54 484 [15]
R：CGC AGG GAC GGT GAT TTT
ermA F：TCT AAA AAG CAT GTA AAA GAA 47 645 [16]
R：CTT CGA TAG TTT ATT AAT ATT AGT
ermB F：GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA 50 639 [16]
R：AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC
ermC F：TCA AAA CATA ATA TAG ATA AA 48 642 [16]
R：GCT AAT ATT GTT TAA ATC GTC AAT
tetW F：GAG AGC CTG CTA TAT GCC AGC 168 59 [17]
R：GGG CGT ATC CAC AAT GTT AAC
tetM F：AGT TTT AGC TCA TGT TGA TG 1863 55 [17]
R：TCC GAC TAT TTA GAC GAC GG
gyrA F：CGG GAT GAA CGA ATT GGG TGT GA 62 241 [18]
R：AAT TTT ACT CAT ACG TGC TTC GG
parC F：TTC CCG TGC ATT TCG ATC AGT ACT TC 62 191 [19]
R：CGT ATG ACA AAG GAT TCG GTA AAT C
fosA F：GCT GCA CGC CCG CTG GAA TA 62 217 [20]
R：CGA CGC CCC CTC GCT TTT GT
fosB F：CAG AGA TAT TTT AGG GGC TGA CA 58 312 [20]
R：CTC AAT CTA TCT TCT AAA CTT CCT G
fosC F：GGG TTA CAT GCC CTT GCT CA 60 354 [20]
R：AAC CCG CAC AAC GAC AGA TG
vatA F：TGG AGT GTG ACA AGA TAG GC 55 512 [21]
R：GTG ACA ACA GCT TCT GCA GC
vatB F：GAA AAG AAT TGA AAA GCC TAA 55 642 [22]
R：CGT GTG TAA GTT CTT AGA ATC
vatC F：ATG AAT TCG CAA AAT CAG CAA GG 60 579 [21]
R：TCG TCT CGA GCT CTA GGT CC
vatD F：GCT CAA TAG GAC CAG GTG TA 55 271 [21]
R：TCC AGC TAA CAT GTA TGG CG
vatE F：ACT ATA CCT GAC GCA AAT GC 52 511 [21]
R：GGT TCA AAT CTT GGT CCG
lsaE F：TTG TAC GGA ATG TAT GG 52 675 [23]
R：TTC GCT TCT ATT AAG CAC TCT T
vgaA F：AGT GGT GGT GAA GTA ACA CG 55 659 [21]
R：CTT GTC TCC TCC GCG AAT AC
vgaB F：TGA CAA TAT GAG TGG TGG TG
R:GCG ACC ATG AAA TTG CTC TC 52 576 [21]
msrC F：AAG GAA TCC TTC TCT CTC CG 52 343 [24]
R：GTA AAC AAA ATC GTT CCC G
vgbA F：TAC AGA GTA CCC ACT ACC GA 52 570 [21]
R：TCA ATT CCT GCT CCA GCA GT
vgbB F：CAG CAG TCT AGA TCA GAG TGG 60 424 [21]
R：CAT ACG GAT CCA TCT TTT CC
rtg1438 F：ATG CAT GAA TTC CGA GGC GGC CGA GGG TTG T 55 550 [25]
R：ATG CAT AAG CTT CCG CGA GCG AGG ACC ACA CG
表选项
1.2.6 毒力基因检测

根据文献[26]，检测asa1、gelE、cylA、esp及hyl。PCR扩增采用50 μl体系：2×Taq MasterMix 25 μl、浓度为10 μmol/L的上下游引物各2.5 μl 加水至48 μl、模板DNA 2 μl；PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；30个循环，最后72 ℃ 10 min完成扩增，相关引物见表 2。

表 2 肠球菌属常见毒力基因PCR检测引物 Table 2 Primers in PCR for detection of virulence genes of Enterococcus
基因名称 毒力因子 引物序列(5′~3′) 产物大小(bp)
asa1 聚合物因子 GCA CGC TAT TAC GAA CTA TGA 375
TAA GAA AGA ACA TCA CCA CGA
gelE 明胶酶 TAT GAC AAT GCT TTT TGG GAT 213
AGA TGC ACC CGA AAT AAT ATA
cylA 细胞溶血素 ACT CGG GGA TTG ATA GGC 688
GCT GCT AAA GCT GCG CTT
esp 肠球菌表面蛋白 AGA TTT CAT CTT TGA TTC TTG G 510
AAT TGA TTC TTT AGC ATC TGG
hyl 透明质酸酶 ACA GAA GAG CTG CAG GAA ATG 276
GAC TGA CGT CCA AGT TTC CAA
表选项
2 结果 2.1 菌株分离鉴定

79份旱獭的肠道标本共分离到3株鹑鸡肠球菌，根据旱獭来源的不同，分别命名为HT 1、HT 20-15、HT 34-7。在哥伦比亚血平板上生长较好；革兰染色为阳性，镜下呈圆球状或椭球状，无芽孢、无鞭毛，属兼性厌氧菌(图 1)。

图 1 3株鹑鸡肠球菌(革兰染色×1000) Figure 1 Gram staining of 3 E. gallinarum(isolates×1000)
图选项

菌株生化结果见表 3。3株菌均能发酵D-核糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-乳糖、D-海藻糖及淀粉；HT 1、HT 20-15 可发酵D-棉子糖，三者均不发酵D-山梨醇、菊糖(菊根粉)、糖原；VP试验、马尿酸钠水解试验、七叶灵、吡咯烷酮芳胺酶试验、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、亮氨酸芳胺酶、精氨酸双水解酶试验均为阳性；碱性磷酸酶试验阴性，无β-溶血现象。

表 3 旱獭鹑鸡肠球菌生化特点 Table 3 Biochemical characteristics of E. gallinarumsisolated from Marmot himalayana
生化反应 HT 1 HT 20－15 HT 34－7 API 参考结果
VP试验 + + + +
马尿酸钠水解试验 + + + +
七叶灵 + + + +
吡咯烷酮芳胺酶试验 + + + +
α-半乳糖苷酶 + + + +
β-葡萄糖醛酸酶 + + + +
β-半乳糖苷酶 + + + +
碱性磷酸酶 － － － －
亮氨酸芳胺酶 + + + +
精氨酸双水解酶 + + + +
D-核糖 + + + +
L-阿拉伯糖 + + + +
D-甘露醇 + + + +
D-山梨醇 － － － －
D-乳糖(牛源) + + + +
D-海藻糖 + + + +
菊糖(菊根粉) － － － +
D-棉子糖 + + － +
淀粉 + + + +
糖原 － － － －
β溶血 － － － －
表选项

扩增测序后获得约1.5 kb大小的16S rRNA基因序列，从公共数据库获得已经发表的肠球菌属52株参考菌株的16S rRNA 基因序列，以单增李斯特菌为外群，使用Neighbor-joining方法构建系统发育图。从图 2可知，分离的3株菌与鹑鸡肠球菌标准菌株E. gallinarum AF 039900.1位于同一分支。

2.2 药敏试验

HT 20-15对利福平中介，3株鹑鸡肠球菌均对奎奴普丁中介，对其他抗菌药物均敏感。

表 4 鹑鸡肠球菌抗菌药物耐药性测定结果 Table 4 Detection results of drug susceptibility ofE.gallinarum isolates
药物名称 药物分类 规格(μg) 药敏结果
HT 1 HT 20-15 HT 34-7
青霉素G 青霉素类 10 S S S
氨苄西林 青霉素类 20 S S S
万古霉素 糖肽类 30 S S S
红霉素 大环内酯类 15 S S S
四环素 四环素类 30 S S S
强力霉素 四环素类 30 S S S
左氧氟沙星 喹诺酮类 5 S S S
环丙沙星 喹诺酮类 5 S S S
呋喃妥因 硝基呋喃类 300 S S S
利福平 利福霉素类 5 S I S
磷霉素 磷霉素类 30 S S S
氯霉素 氯霉素类 30 S S S
奎奴普丁 链阳性菌素类 15 I I I
利奈唑胺 唑烷酮类 30 S S S
高浓度庆大霉素 氨基糖苷类 120 S S S
注：S(Sensitive)，敏感； I(Intermidiate)，中介。
表选项
图 2 Neighbor-joining 方法构建的基于16S rRNA序列的肠球菌属系统发育图 Figure 2 Neighbour-joining phylogenic tree ofEnterococcus based on 16S rRNA sequence
图选项
2.3 毒力基因及耐药基因检测 2.3.1 耐药基因检测

3株鹑鸡肠球菌的低浓度万古霉素耐药相关基因vanC1阳性，青霉素类耐药相关基因pbp5C、pbp5C，万古霉素耐药相关基因vanA、vanB及vanC2，红霉素耐药相关基因ermA、ermB、ermC，四环素类耐药相关基因tetW、tetM，喹诺酮类抗生素耐药相关基因gyrA、parC，利福平耐药相关基因rtg1438，磷霉素类耐药相关基因fosA、fosB、fosC，奎奴普丁耐药相关基因vatA、vatB、vatC、vatD、vatE、lsaE、msrC、vgaA、vgaB、vgbA、vgbB均为阴性。

2.3.2 毒力基因检测

3株菌中均未检测到聚合物因子基因(asa1)、明胶酶基因(gelE)、细胞溶血素基因(cylA)、肠球菌表面蛋白基因(esp)及透明质酸酶基因(hyl)。

3 讨论

鹑鸡肠球菌临床报道分离率低于粪肠球菌、屎肠球菌，可引起院内感染暴发，是重要的院内感染病原菌。由于开展的分离工作和研究较少，现有报道可能并不能反映实际情况。目前我国鹑鸡肠球菌的研究多集中于从院感患者分离病原菌并对其进行耐药性分析[27-29]。西班牙报道鹑鸡肠球菌在一些野生动物的分离率可高达50%左右[7]，提示其在野生动物中可能广泛存在，医学意义可能被低估。根据美国食品药品管理局的研究表明，从奶牛及禽类等与人类密切接触的动物体内分离的鹑鸡肠球菌对万古霉素、庆大霉素、链阳酶素、四环素、红霉素、杆菌肽及环丙沙星等多种抗菌药物耐药；此外，从临床样本中分离的1株鹑鸡肠球菌经证实含有毒力基因cylA及esp[30]。我国鹑鸡肠球菌的耐药情况也较为严重，其对多种抗菌药物耐药；广东省报道从临床分离的30株鹑鸡肠球菌对青霉素耐药率高达95%以上，对红霉素、利福平、环丙沙星、庆大霉素及四环素的耐药率均高达70%以上[31]。

3株菌生化结果显示均不发酵菊糖，HT 34-7不发酵D-棉子糖。经计算API编码值并使用apiweb软件判读结果，鉴定为鹑鸡肠球菌。在16S rRNA 基因系统发育图中，HT 1、HT 20-15及HT 34-7与鹑鸡肠球菌标准菌株AF039900.1聚类于同一分支，表明在进化关系上3株菌与鹑鸡肠球菌同源性最高。经生化反应及16S rRNA 基因序列聚类分析，最终鉴定3株菌株为鹑鸡肠球菌。

不同于其他研究中分离的菌株，喜马拉雅旱獭肠道分离的3株鹑鸡肠球菌对15种常见抗菌药物均不耐药，且不携带常见的肠球菌属毒力基因和耐药基因。

喜马拉雅旱獭是青藏高原的特有物种，也是鼠疫菌的重要动物宿主之一。我国鼠疫防控的重要措施是严格限制人类和旱獭接触。因此，喜马拉雅旱獭肠道菌群相对而言较少或几乎没有受到人类的影响。从喜马拉雅旱獭中分离到3株鹑鸡肠球菌未检测到毒力基因和耐药基因，提示鹑鸡肠球菌最初可能来源于动物且未携带耐药基因及毒力基因，对人类无致病性。随着抗菌药物在畜牧业生产中的大量使用，细菌可能在进化过程中获得耐药基因以及毒力基因，最终产生耐药性和致病性。

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