单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是一种革兰阳性、兼性厌氧的短杆菌，广泛分布于环境及食品中^[1]。该菌作为一种重要的食源性病原菌，可引起人和动物李斯特菌病的散发和暴发。单增李斯特菌主要感染免疫力低下(老年人、孕妇及新生儿)和免疫缺陷的人群，临床表现为发热性胃肠炎、败血症、中枢神经系统损害、早产、流产以及死产^[2]。

在食品加工环境中，生物膜是一个潜在的食品微生物污染源，可导致食品变质及食源性病原体的传播^[3]。单增李斯特菌能附着于生物或非生物表面形成生物膜，从而获得耐高温、高盐、干燥以及抵抗消毒剂、抗菌药物、紫外线的能力^[4-5]。生物膜形成能力赋予了单增李斯特菌更好的抗性，能够适应各类食品及加工环境，成为食源性李斯特菌病暴发和散发潜在的污染源。研究发现，单增李斯特菌生物膜的形成受相关基因调控，且这些生物膜相关基因作用于生物膜形成的不同阶段，如flaA、degU、agrA和luxS等基因参与早期生物膜形成，而yneA、recA、relA、hpt和prfA等基因则作用于生物膜成熟阶段^[6]。此外，单增李斯特菌在肉类食品及加工厂的存在还与抗药性相关，与其他食源性病原菌相比较，单增李斯特菌耐药株很少，近年来，耐药株的报道逐渐增加^[7-8]。目前，在养殖业中存在大量的抗生素滥用现象，单增李斯特菌经常暴露于亚致死浓度的抗生素中，导致其对相应抗生素的耐药性增加^[9]。

单增李斯特菌依据血清凝集实验，可分为13个血清型(1/2a、 1/2b、 1/2c、 3a、 3b、 3c、 7、 4a、 4b、 4ab、 4c、 4d和4c)，其中1/2c作为重要的食源性菌株，常分离自各种食品^[10]。在中国，食源性单增李斯特菌分离株大部分也为1/2c血清型^[11]。本实验室前期调查证实，从市场采集的生肉制品中分离到的单增李斯特菌以1/2c血清型为主，而其他血清型菌株分离较少^[12]。笔者前期已开展的菌株适应能力相关研究证实，在室温、富营养/低营养条件、中性略偏碱性环境中1/2c血清型菌株生物膜形成能力强于其他血清型菌株^[13]，但其详细机制不清楚。为此选取1/2c及其他血清型菌株共40株，进行19个生物膜相关基因(flaA、motB、degU、agrA、agrD、luxS、lmo0753、gltC、lmo2504、lmo1386、divIVA、HrcA、Dnak、sigB、yneA、recA、relA、hpt、prfA)的全长扩增测序分析^[14-30]，并与GenBank下载的不同血清型的生物膜相关基因进行氨基酸序列比对，了解生物膜形成能力与相关基因之间的关系。同时选取1/2c血清型单增李斯特菌51株和其他血清型菌19株，进行32种抗生素的药物敏感性实验，探究单增李斯特菌1/2c血清型菌株耐药情况是否与其高污染率相关，从而为我国食源性1/2c血清型单增李斯特菌高污染率的相关性提供可能的线索。

进行生物膜相关基因检测的实验菌株，根据本实验室前期生物膜形成能力实验结果选取^[13]，见表 1。1/2a血清型单增李斯特菌参考菌株EGD-e作为实验对照菌株。耐药实验选取的实验菌株见表 1，并选取金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌株。

脑心浸液(BHI)购自北京陆桥技术有限公司；无水乙醇购自北京化工厂；恒温振荡器购自美国精骐公司；生化培养箱(ICP600)购自德国Memmert公司；DNA提取试剂盒购自北京康为世纪公司；2× Taq Masterix购自北京康为世纪公司；PCR仪购自德国Senso公司；电泳仪、凝胶成像系统购自美国Bio-rad公司；药敏纸片、药敏纸片分配器购自Sigma公司；M-H平板购自宝特生物公司；引物合成及测序由北京擎科新业生物技术公司完成。

细菌基因组DNA提取方法详见细菌基因组DNA提取试剂盒，制备的DNA模板保存于-20 ℃。

对40株单增李斯特菌的19种生物膜相关基因全长进行聚合酶联反应(PCR)扩增检测并对产物片段进行双向测序分析，19种基因的全长引物及退火温度见表 2，其中部分基因的全长引物及退火温度参照叶正兴等^[31]使用的方法。

药敏试验参照美国临床和实验室标准委员会(CLSI)推荐的 K-B纸片法。在MH平板上均匀涂布0.5麦氏单位的待检细菌，用药敏纸片分配器将药敏纸片平整的放置在MH平板上，于37 ℃培养18～24 h。读取抑菌环直径。以金黄色葡萄球菌ATCC25923为质控菌株。药敏结果判断标准参照美国2012年CLSI标准。

运用PCR扩增技术，对40株单增李斯特菌的19种生物膜形成相关基因进行全长扩增，3次重复实验结果均为阳性，表明40株菌均含有19种基因。将被检菌株的生物膜相关基因的测序结果与GenBank下载的不同血清型的生物膜相关基因进行氨基酸序列比对，发现flaA、luxS、prfA 基因编码的氨基酸位点突变呈现一定规律性：其中有23株1/2c血清型菌株在flaA基因编码氨基酸的第141位点由 T→I，仅有1株未发生突变，而其他血清型菌株在此位点不发生突变，见表 3；1/2c血清型的prfA基因编码氨基酸的第89位点不发生突变，而1/2b、4a、4b、4c血清型菌株氨基酸在第89位点由T→A，1/2a、3a血清型分别有62.5%和27.27%的菌株氨基酸在第89位点由T→A，见表 4；1/2c血清型菌株在luxS基因编码氨基酸的第112、140位点均未发生突变，1/2b、4a、4b血清型菌株在112、140位点氨基酸分别由V→A、E→A，4c血清型菌株在112、140位点氨基酸分别由V→Q、E→A，1/2a、3a血清型有75%的菌株在第112、140位点氨基酸分别由V→Q、E→A，见表 5。

药敏实验结果显示，单增李斯特菌菌株对大部分抗生素敏感；对氨苄西林、青霉素、四环素、米诺环素、美罗培南、诺氟沙星、利福平、头孢新钠、氯霉素、头孢西丁、呋喃妥因等抗生素呈不同程度的耐药；对苯唑西林、多粘菌素B完全耐药。大部分1/2c血清型菌株对头孢西丁中度敏感，中敏率高达78.43%，其中8株1/2c血清型菌株对头孢西丁完全耐药，耐药率为15.68%，仅3株1/2c血清型菌株对头孢西丁敏感。此外，1/2c血清型菌株对氨苄西林、米诺环素、利福平和呋喃妥因也有不同程度的耐药，其他血清型则敏感，见表 6。

单增李斯特菌作为一种重要的食源性病原体，广泛分布于环境中，引起李斯特菌病的暴发和散发。由于具有生物膜形成能力，其获得抵抗高温、紫外线、消毒剂等的能力，导致单增李斯特菌在各类食品及加工厂中存在，成为食品安全的潜在威胁。近年来，抗生素在养殖畜牧业的滥用，单增李斯特菌耐药株的报道逐年增加，尤其是来自肉类食品的分离株，呈现多种抗生素耐药，进一步赋予了单增李斯特菌在食品和环境中的生存能力，从而为食品卫生及临床治疗带来了更大的困难。

生物膜是由细菌分泌的胞外多聚物包被而形成的细菌群体结构，有助于细菌黏附于生物或非生物表面^[32]。研究证明，食源性病原体生物膜的形成是导致食品污染的主要原因，然而，影响细菌生物膜形成的因素多且复杂。其中，生物膜的形成受基因表达和调控的控制，目前为止，已发现的与生物膜形成相关基因有很多^[14-30]。本研究选取19个生物膜相关基因并对其进行基因序列检测分析，不同血清型的flaA、luxS、prfA 3个基因编码的氨基酸在某些位点突变有一定的规律性。flaA基因编码单增李斯特菌鞭毛，表达产物促进生物膜的形成^[14]。prfA基因调控大多数毒力基因，影响生物膜的形成，是通过一个未知方式间接地结合到调控相关毒力因子的启动子上，目前只有hpt、inlA 2个由prfA调控的毒力基因与生物膜形成相关^[29-30]。luxS基因编码蛋白催化S-核糖基同型半胱氨酸分解为同型半胱氨酸和自溶素-2(AI-2)前体，而S-核糖基同型半胱氨酸刺激单增李斯特菌形成致密生物膜，缺失luxS基因后单增李斯特菌生物膜形成能力增强^[17]。本实验发现不同血清型单增李斯特菌在flaA、luxS、prfA基因的某些位点的碱基突变导致所编码的氨基酸发生了改变。由于影响生物膜形成的因素很多，基因位点发生的突变是否与单增李斯特菌不同血清型生物膜形成能力的差异有关，需进一步研究证实。

抗菌药物在临床和畜牧中使用已超过60年的时间，农业中抗生素被用于预防、控制、治疗感染，促进家畜的生长和增加进食量^[33-34]。Kovacevic 等^[35]发现单增李斯特菌对萘啶酮酸完全耐药，对头孢西丁耐药率为95%，对环丙沙星、四环素、氯林可霉素有不同程度的耐药。而Camargo等^[36]则发现单增李斯特菌对氯林可霉素(52.5%)、苯唑西林(56.9%)有较高的耐药率，对庆大霉素、氯霉素、利福平、亚胺培南、万古霉素、红霉素、氨苄西林、青霉素、四环素则敏感。本研究所检测的单增李斯特菌中大部分1/2c血清型菌株对头孢西丁中度敏感(78.43%)；1/2c血清型菌株对氨苄西林(3.92%)、米诺环素(1.96%)、利福平(1.96%)、呋喃妥因(1.96%)有不同程度的耐药，而其他血清型则敏感。这些抗生素在动物治疗中并不是首选，但养殖业中抗生素滥用现象严重。单增李斯特菌1/2c血清型菌株对头孢西丁、氨苄西林、米诺环素、利福平和呋喃妥因有不同程度的耐药，是否与1/2c血清型菌株在食品中高污染率有关，还需进一步研究证实。