疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (5): 422-426

扩展功能

文章信息

李存香, 王鹏, 李伟, 李振军
LI Cun-xiang, WANG Peng, LI Wei, LI Zhen-jun
噬菌体分子分型技术研究进展
Progress in research of phage molecule typing techniques
疾病监测, 2016, 31(5): 422-426
Disease Surveillance, 2016, 31(5): 422-426
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.05.016

文章历史

收稿日期：2015-12-30
引用本文 0
李存香, 王鹏, 李伟, 李振军. 噬菌体分子分型技术研究进展[J]. 疾病监测, 2016, 31(5): 422-426.
LI Cun-xiang, WANG Peng, LI Wei, LI Zhen-jun. Progress in research of phage molecule typing techniques[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(5): 422-426.
噬菌体分子分型技术研究进展
李存香1,2,3, 王鹏4, 李伟1, 李振军1     
1. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
2. 中国疾病预防控制中心研究生院, 北京 100206;
3. 青海省地方病预防控制所鼠疫预防控制科, 青海 西宁 811602;
4. 云南地方病防治所, 云南 大理 671000
收稿日期: 2015-12-30
基金项目: 云南省自然疫源性传染病重点实验室开放课题(No.ZD201503)
作者简介: 李存香,女,青海省海东市人,在读硕士研究生,主要从事鼠疫病原学研究和鼠疫防治工作
作者贡献: 李存香：搜集文献、撰写论文
王鹏：论文撰写指导与修改
李伟：论文撰写指导与修改、润色语言
李振军：论文指导工作
通信作者: 李伟,Tel:010-58900770,Email:liwei@icdc.cn;李振军,Tel:010-58900760,Email:lizhenjun@icdc.cn.
摘要: 噬菌体是细菌(包括放线菌、蓝绿藻、螺旋体和支原体等)的寄生病毒,在自然界广泛分布。基于细菌噬菌体核酸或蛋白的分子分型研究对认识噬菌体多态性及种群结构,推论宿主菌和噬菌体系统进化,明晰噬菌体和宿主菌相互作用具有重要意义。本研究介绍了噬菌体分子分型技术和应用的研究进展,重点从噬菌体全基因组测序、限制性片段长度多态性分析、随机扩增多态性DNA分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、保守基因多位点序列分型等方面阐述新近分子分型技术在噬菌体分型和种群关系研究中的应用。
关键词： 噬菌体     分子分型技术     多态性     进化     种群    
Progress in research of phage molecule typing techniques
LI Cun-xiang1,2,3, WANG Peng4, LI Wei1, LI Zhen-jun1     
1. State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control, Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
2. Graduate school, Chinese Center for Disease Control and Prevetion, Beijing 102206, China;
3. Qinghai Provincial Institute for Endemic Disease Prevention and Control, Xining 811602, Qinghai, China;
4. Yunnan Provincial Institute for Endemic Disease Prevention and Prevention, Dali 671000, Yunan, China
Abstract: Phages are abundant viruses in bacteria in nature, including Actinomycetes, Blue-green algae, Spirochaeta, Mycoplasma and so on. Molecular typing studies based on nucleic acid and protein of phage have important significance to educt the co-evolution and mutual relationship between bacteria and phage. The paper summarizes the progress in research of molecular typing techniques of phage, including whole genome sequencing, restriction fragment length polymorphism, random amplified polymorphic DNA, SDS polyacrylamide gel electrophoresis and multilocus sequence typing.
Key words: Phage     Molecular subtyping technique     Polymorphism     Evolvement     Population    

噬菌体(bacteriophage，phage)是一类寄生于细菌、放线菌、蓝绿藻、螺旋体和支原体等微生物体内的病毒。它在自然界广泛分布，其数目是细菌的10倍[1]。凡是有原核微生物的地方，都有相应种类噬菌体存在。噬菌体的鉴定、分类和分型是噬菌体研究的基础工作。依据噬菌体感染宿主菌的生物学后果，可将其分为溶源噬菌体和裂解噬菌体。依据电子显微镜下的形态不同，可分为蝌蚪型、微球型和丝状3种基本形态。噬菌体在生态系统和微生物的进化过程中扮演着非常重要的“角色”[2]。其基因排列呈模块镶嵌化，可用于遗传特征分析的保守基因较少，使噬菌体分子分型不完全同于细菌分型。本研究从以下6个方面对噬菌体分子分型技术和应用进行概述，着重介绍目前分子分型技术在描述噬菌体多态性，阐释噬菌体和宿主菌的相互作用和进化关系等方面的应用。

1 全基因组测序

目前噬菌体全基因组大量测序，研究者已经开始利用基因组比对等手段对噬菌体进行分类或分型[3-4]。研究发现，同一宿主菌的不同噬菌体存在着形态、生物学性状及基因组的巨大差异[5]。如Fouts等[6]研究O139血清群霍乱弧菌(Vibrio cholerae)孟加拉株的短尾噬菌体φVchO139-Ⅰ和φJA1的形态特征，发现φJA1产生较大的晕环，这种现象可能是在噬菌体和细菌相互作用中多糖聚解酶的分泌使O139荚膜多糖降解有关。φVchO139-Ⅰ和φJA1尽管形态相似，但φVchO139-Ⅰ噬菌斑周围晕环比φJA1大，这种晕环的不同可能归因于二者基因表达水平变化、分泌的裂解酶活性或裂解量。全基因组测序揭示尽管二者一致性为99%，但其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)差异明显，有298个不同的SNPs和2个小的插入/删除序列。尽管2个噬菌体的79个预测蛋白质编码序列中相同的只有59个，但二者与其他N4类噬菌体进行基因组比较，结果显示在这个噬菌体家族中φVchO139-Ⅰ和φJA1在同一个演化支上。Yep-phi是中国分离的鼠疫诊断用噬菌体，PhiA1122是美国疾病预防控制中心(CDC)用于鼠疫诊断的噬菌体，二者在形态学上都属于短尾病毒科，但是Yep-phi在20 ℃和37 ℃均特异裂解鼠疫菌，PhiA1122除了裂解鼠疫菌，在 37 ℃还可以裂解部分假结核耶尔森菌，说明Yep-phi比PhiA1122具有更好的特异性。在鼠疫噬菌体的研究中，Zhao等[7]对鼠疫噬菌体Yep-phi 进行全基因组测序，并与已测序的同属 T7 家族的鼠疫菌噬菌体 PhiA1122、 Berlin和Yepe2 进行了比较基因组学分析，结果提示这 4 株烈性噬菌体可以分为2个亚群：Yep-phi 亚群(Yep-phi、Berlin 和 Yepe2)和 PhiA1122 亚群(PhiA1122)。其中PhiA1122与 T7噬菌体同源性为89.1%，而Yep-phi与 T7噬菌体同源性只有 61.0%，但是Yep-phi 、 Berlin (98.0%)和 Yepe2(95.9%)高度同源。在Yep-phi亚群中预测到4个重组事件，说明这3株噬菌体在进化上是密切相关的。

基因组测序发现分离自同一个菌种(属)的表型相似的噬菌体其基因组呈现多态性，甚至分离自同一种(属)宿主菌的噬菌体比分离自不同种(属)的噬菌体之间的遗传差别还大。有时不同形态或生物表型的噬菌体的基因序列却存在相似性。 Lynch等[8]研究2株表型形态相似的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)的长尾噬菌体KL1和AH2，测序发现同源序列少，而KL1噬菌体和假单胞菌(Pseudomonas)噬菌体PA73密切相关，二者基因组序列相似性超过69%；AH2和伯克霍尔德菌(Burkholderia)噬菌体BcepNazgul密切相关，二者基因组序列相似性超过16%。Peters等[9]从嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)D1585中分离2株表型完全不同的长尾噬菌体DLP1和DLP2，它们在宿主谱和生长动力学方面亦表现出显著性差异。但全基因组测序分析表明二者存在遗传上的近源性，即97.2%基因组中一致性为96.7%。另外，这2株噬菌体同绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体PA25、PA73、Ab26也存在同源性，其中与PA25 基因一致性分别为98%、97%，与PA73 基因组中一致性分别为98%、98%，与Ab26 基因一致性为96%、97%，由此可见，二者同绿脓假单胞菌噬菌体PA25遗传距离更近。噬菌体高频率的基因水平转移是噬菌体基因组多样性的主要原因[5]。 Pope等[10]为推断宿主菌噬菌体的种群结构，对627株耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体进行测序，这些噬菌体基因组水平上存在共同的来源，但之后有多次的基因插入，因此形成了28个基因型(簇)。

由于噬菌体基因差异巨大且为镶嵌结构，有时基因组序列的比较难以开展或结果难以解释。因此依据噬菌体基因组序列转为蛋白序列分析是另外一种基于基因组比较的技术手段。卢曙光[11]对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体PaP1、JG004、PAK_P1 和vB_PaeM_C2-10_Ab1 测序后进行比较基因组学分析，并根据其在DNA和蛋白质水平上相似的基因组序列、明显的核心基因及紧密的系统发生关系，建立了铜绿假单胞菌肌尾噬菌体的一个新属:PaP1 样噬菌体属。

2 限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)

RFLP被广泛用于基因组种群分型和基因定位等研究。RFLP是根据不同物种基因组上限制性内切酶的酶切位点的差异，描述序列水平上酶切位点差异形成的核酸酶切片段大小(通过电泳分析)的多态性。Lynch等[8]在洋葱伯克霍尔德菌的噬菌体KL1和AH2全基因组测序前对这2个噬菌体通过限制性核酸内切酶EcoRⅠ开展RFLP分析提示它们的序列不同。Barrangou等[12]从德国泡菜中分离到裂解明串珠菌(Leuconostoc fallax)的3株长尾噬菌体(Siphoviridae)和3株肌尾噬菌体(Myoviridae)。通过RFLP分析(BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ内切酶)其酶切图谱不同但存在共同的3个条带。 Wittmann 等[13]从德国污水处理厂和堆肥土壤中分离包含短尾噬菌体(Podoviridae)、长尾噬菌体和肌尾噬菌体3种的34株白色杆菌噬菌体。通过限制性核酸内切酶(Ndel)分析图谱显示多态性。对81株嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)噬菌体通过限制性核酸内切酶EcoRⅠ和PvuⅡ酶切分析[14]，41株干奶酪噬菌体有35种酶切图谱，40株酸奶酪噬菌体有11种酶切图谱。Merabishvili等[15]利用RFLP技术酶切69株有尾噬菌体并数字化其图谱结果，发现宿主菌基因型和/或血清型与噬菌体集群密切相关，而噬菌体基因型与宿主范围并不完全对应。通过紫外线诱导31株志贺毒素大肠埃希菌(VTEC)O103∶H2释放32株噬菌体，通过限制性核酸内切酶Ndel进行RFLP分析和系统树描述噬菌体间的关系，32株噬菌体有21种图谱，其中17种是单一噬菌体图谱，4种是多重噬菌体图谱，相似性指数为44.92%[16]。

RFLP噬菌体分子分型的技术在分析噬菌体核酸差别具有快速、简便和重复性好等优点，在初步分析噬菌体基因组差别上具有很高的应用价值。但是，RFLP对噬菌体DNA制备质量要求高，需要量大。脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)也是一种分析大分子DNA长度(大小)差别的方法，可以用来分离10 kb到10 Mb大小的DNA分子。通过RFGE图可大致推断出噬菌体的基因组长度[17-18]。在噬菌体基因组酶切后若进行PFGE可以获得更为清晰的电泳图谱[19]。

3 随机扩增多态性DNA分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)

RAPD是一种基于PCR扩增多态性的分子分型方法。它通过扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。Zago 等[20]通过RAPD-PCR方法和宿主裂解谱发现21株瑞士乳酸菌(Lactobacillus helveticus)噬菌体存在生物多样性。Cortés 等[21]通过裂解谱、限制性酶切和RAPD-PCR方法对西班牙不同的农场家禽和猪的排泄物中分离到的55株沙门菌(Salmonella)噬菌体进行鉴定，结果显示没有任何相同的RAPD-PCR 模式，说明从农场动物排泄物中分离的沙门菌噬菌体呈现显著的多态性。通过RAPD-PCR分析6株明串珠菌(Leuconostoc fallax)噬菌体的遗传特征，利用引物B发现它们的基因组是独特的，利用引物A发现相同家族的噬菌体有相似的条带。由此可见，两个不同系列的试验获得的相对强度的图谱条带并不一致[12]。

RAPD方法具有简便、通用等优点，对模板 DNA的纯度要求不高，可以在物种没有任何分子生物学研究的情况下分析其DNA多态性。但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响，如基因组DNA结构的复杂性、短的引物序列、PCR的循环次数、技术设备等，其反应的稳定性、重复性较差。

4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

噬菌体基因组所编码的蛋白包括噬菌体结构蛋白和一些调节蛋白(主要在宿主菌内表达分泌)。不同的噬菌体其结构蛋白不尽相同。纯化的噬菌体颗粒进行SDS-PAGE可以分析噬菌体结构蛋白的差异。Barrangou等[12]用SDS-PAGE蛋白图谱分析德国泡菜中分离的6株属于不同家族的明串珠噬菌体，发现3株肌尾噬菌体表现出相同的结构蛋白且带有2个主要蛋白，3株长尾噬菌体表现出2种图谱，其中1株的结构蛋白带有2个主要蛋白，另外2株带有3个主要蛋白。SDS-PAGE分析噬菌体蛋白成分进而研究其在结构蛋白大小上的相似性是噬菌体分析的一种重要方法。其局限性包括SDS-PAGE只能对噬菌体蛋白进行分离，且停留在仅仅了解噬菌体蛋白数量及分子质量大小的水平，而对每种蛋白质实际序列差别和功能了解甚少。

5 多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)

利用对某个噬菌体基因进行测序分析的应用，在噬菌体中可以被用作测序分析的保守基因较少，目前已经得到应用的包括细菌溶菌素(lys)基因[22]、卷尺测量蛋白(tape measure protein，TMP)[23]、病毒头部组装蛋白g20(capsid assembly proteing 20)[24]、DNA 聚合酶基因(DNA polymerase，DNA pol)等[25]。具体应用如Doria等[23]从37株酒球菌中分离出15株温和噬菌体，通过溶菌素(lys)基因进行多态性分析，将其分成12个不同的群。TMP(tape measure protein)是分枝杆菌噬菌体基因组中的保守基因。利用单基因TMP鉴定了247株分枝杆菌噬菌体群和亚群[23]。Zhong等[24]根据对蓝细菌肌尾噬菌体g20基因的进化分析，提出了蓝细菌肌尾噬菌体g20基因存在9个类群。蓝细菌肌尾噬菌体的基因型并没有因宿主的不同而有明显的区分，即聚球藻与原绿球藻的肌尾噬菌体关系反而更密切。基于DNA pol揭示了蓝细菌短尾噬菌体的多样性与类群组成，Wang和Chen[25]设计了一对引物扩增蓝细菌短尾噬菌体中的DNA pol序列。利用这对引物将蓝细菌短尾噬菌体分为两个类群，即MPP-A与MPP-B(marine picocyanobaeteria podovirus A，B)。在这两个类群中，MPP-B包括聚球藻与原绿球藻的短尾噬菌体，而MPP-A目前只包括聚球藻的短尾噬菌体。在研究T4噬菌体遗传距离的研究中，以噬菌体颗粒的3个主要结构蛋白(尾鞘蛋白gpl8、尾管蛋白gpl9、主要衣壳蛋白gp23)序列的比较为基础，可以将T4噬菌体进一步分成四个亚群：即T-evens、pseudo T-evens、schizo T-evens和exo T-evens。这种分型方法与其形态学数据是相关的[26]。分枝杆菌噬菌体已经有68个核心基因组得到测序，比较发现A类核心基因非常保守，最适合被用来鉴定分枝杆菌噬菌体[27]。

多个保守基因测序和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析即多位点序列分型(MLST)分析方法。细菌MLST分析是细菌种群水平上分子分型的常用方法。MLST常用于细菌的种群和系统发生关系分析。最近Moisan和Moineau [26]将感染乳酸乳球菌的100株936类噬菌体针对5个高度保守基因序列，利用MLST鉴别为93个不同序列型，通过聚类分析显示这些噬菌体宿主谱的高一致性和克隆进化。针对多个保守基因位点测序分析的MLST方法简单，结果客观，重复性好，易于实验室间传递和比较。但受噬菌体序列保守性低的限制，该方法的应用还不广泛。

6 结语

当前高通量测序及蛋白质质谱鉴定技术的发展和应用，极大地提高人们对噬菌体遗传信息和蛋白结构及功能的认识。基因组学技术的迅猛发展，噬菌体组学也被提到科学认识的范畴。随着对噬菌体认识的不断深入，分子生物学研究会在噬菌体的生物学和噬菌体应用中发挥重要作用。

参考文献
[1] 陆承平. 兽医微生物学[M].3版. 北京: 中国农业出版社, 2001 . Lu CP. Veterinary microbiology[M].3rd ed. Beijing: China Agriculture Press, 2001 .
[2] Frost LS, Leplae R, Summers AO, et al. Mobile genetic elements: the agents of open source evolution[J]. Nat Rev Microbiol, 2005, 3 (9) : 722–732 .
[3] Golomidova AK, Kulikov EE, Prokhorov NS, et al. Complete genome sequences of T5-related Escherichia coli bacteriophages DT57C and DT571/2 isolated from horse feces[J]. Arch Virol, 2015, 160 (12) : 3133–3137 .
[4] Senčilo A, Luhtanen AM, Saarijärvi M, et al. Cold-active bacteriophages from the Baltic Sea ice have diverse genomes and virus-host interactions[J]. Environ Microbiol, 2015, 17 (10) : 3628–3641 .
[5] Shaburova OV, Hertveldt K, de la Crus DMA, et al. Comparison of new giant bacteriophages OBP and LuU of soil pseudomonads with bacteriophages of the φKZ-supergroup of Pseudomonas aeruginosa[J]. Russ J Genet, 2006, 42 (8) : 877–885 .
[6] Fouts DE, Klumpp J, Bishop-Lilly KA, et al. Whole genome sequencing and comparative genomic analyses of two Vibrio cholerae O139 Bengal-specific Podoviruses to other N4-like phages reveal extensive genetic diversity[J]. Virol J, 2013 : 165.
[7] Zhao XN, Wu WL, Qi ZZ, et al. The complete genome sequence and proteomics of Yersinia pestis phage Yep-phi[J]. J Gen Virol, 2011, 92 (1) : 216–221 .
[8] Lynch KH, Stothard P, Dennis JJ. Comparative analysis of two phenotypically-similar but genomically-distinct Burkholderiaceno cepacia-specific bacteriophages[J]. BMC Genomics, 2012 : 223.
[9] Peters DL, Lynch KH, Stothard P, et al. The isolation and characterization of two Stenotrophomonas maltophilia bacteriophages capable of cross-taxonomic order infectivity[J]. BMC Genomics, 2015 : 664.
[10] Pope WH, Bowman CA, Russell DA, et al. Whole genome comparison of a large collection of mycobacteriophages reveals a continuum of phage genetic diversity[J]. eLife, 2015 : .
[11] 卢曙光. 铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的基因组学研究: 一种由Endonuclease Ⅴ介导的细菌免疫新机制的发现与证实[D]. 重庆: 第三军医大学,2013. Lu SG. Genomic analysis of the Pseudomonas aeruginosa phage PaP1: evidence of a novel immunity mechanism of bacteria mediated by Endonuclease Ⅴ[D].Chongqing: Third Military Medical University,2013. (in Chinese)
[12] Barrangou R, Yoon SS, Breidt Jr F, et al. Characterization of six Leuconostoc fallax bacteriophages isolated from an industrial sauerkraut fermentation[J]. Appl Environ Microbiol, 2002, 68 (11) : 5452–5458 .
[13] Wittmann J, Dreiseikelmann B, Rohde C, et al. Isolation and characterization of numerous novel phages targeting diverse strains of the ubiquitous and opportunistic pathogen Achromobacter xylosoxidans[J]. PLoS One, 2014, 9 (1) : .
[14] Brussow H, Fremont M, Bruttin A, et al. Detection and classification of Streptococcus thermophilus bacteriophages isolated from industrial milk fermentation[J]. Appl Environ Microbiol, 1994, 60 (12) : 4537–4543 .
[15] Merabishvili M, Verhelst R, Glonti T, et al. Digitized fluorescent RFLP analysis (fRFLP) as a universal method for comparing genomes of culturableds DNA viruses: application to bacteriophages[J]. Res Microbiol, 2007, 158 (7) : 572–581 .
[16] Karama M, Gyles CL. Characterization of verotoxin-encoding phages from Escherichia coli O103: H2 strains of bovine and human origins[J]. Appl Environ Microbiol, 2008, 74 (16) : 5153–5158 .
[17] Ahmad AA, Ogawa M, Kawasaki T, et al. Characterization of bacteriophages Cp1 and Cp2, the strain-typing agents for Xanthomonas axonopodis pv. citri[J]. Appl Environ Microbiol,, 2014, 80 (1) : 77–85 .
[18] Czajkowski R, Ozymko Z, de Jager V, et al. Genomic, proteomic and morphological characterization of two novel broad host lytic bacteriophages φPD10.3 and φPD23.1 infecting pectinolytic Pectobacterium spp. and Dickeya spp[J]. PLoS One, 2015, 10 (3) : .
[19] Barton C, Ng LK, Tyler SD, et al. Temperate bacteriophages affect pulsed-field gel electrophoresis patterns of Campylobacter jejuni[J]. Clin Microbiol, 2007, 45 (2) : 386–391 .
[20] Zago M, Bonvini B, Rossetti L, et al. Biodiversity of Lactobacillus helveticus bacteriophages isolated from cheese whey starters[J]. J Dairy Res, 2015, 82 (2) : 242–247 .
[21] Cortés P, Spricigo DA, Bardina C, et al. Remarkable diversity of Salmonella bacteriophages in swine and poultry[J]. FEMS Microbiol Lett, 2015, 362 (2) : 1–7 .
[22] Doria F, Napoli C, Costantini A, et al. Development of a new method for detection and identification of Oenococcus oeni bacteriophages based on endolysin gene sequence and randomly amplified polymorphic DNA[J]. Appl Environ Microbiol, 2013, 79 (16) : 4799–4805 .
[23] Smith KC, Castro-Nallar E, Fisher JNB, et al. Phage cluster relationships identified through single gene analysis[J]. BMC Genomics, 2013 : 410.
[24] Zhong Y, Chen F, Wilhelm SW, et al. Phylogenetic diversity of marine cyanophageisolates and natural virus communities as revealed by sequences of viral capsid assembly protein gene g20[J]. Appl Environ Microbiol, 2002, 68 (4) : 1576–1584 .
[25] Wang K, Chen F. Prevalence of highly host-specific cyanophages in the estuarine environment[J]. Environ Microbiol, 2008, 10 (2) : 300–312 .
[26] Moisan M, Moineau S. Multilocus sequence typing scheme for the characterization of 936-Like phages infecting Lactococcus lactis[J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78 (13) : 4646–4653 .
[27] 樊祥宇. 分枝杆菌噬菌体的系统生物学研究[D]. 重庆: 西南大学,2014. Fan XY. The systems biology of mycobacteriophage[D].Chongqing: Southwest University,2014. (in Chinese)