疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (5): 433-436

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龙永艳, 倪贤生, 李端, 王瑞白, 陈海婴, 李娟, 阚飙
LONG Yong-yan, NI Xian-sheng, LI Duan, WANG Rui-bai, CHEN Hai-ying, LI Juan, KAN Biao
食品从业人员肠道细菌CTX-M 型超广谱β-内酰胺酶的携带状况研究
Carriage of CTX-M type extended-spectrum β-lactamase in intestinal bacteria isolated from people engaged in food processing
疾病监测, 2016, 31(5): 433-436
Disease Surveillance, 2016, 31(5): 433-436
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.05.018

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收稿日期：2016-01-12
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龙永艳, 倪贤生, 李端, 王瑞白, 陈海婴, 李娟, 阚飙. 食品从业人员肠道细菌CTX-M 型超广谱β-内酰胺酶的携带状况研究[J]. 疾病监测, 2016, 31(5): 433-436.
LONG Yong-yan, NI Xian-sheng, LI Duan, WANG Rui-bai, CHEN Hai-ying, LI Juan, KAN Biao. Carriage of CTX-M type extended-spectrum β-lactamase in intestinal bacteria isolated from people engaged in food processing[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(5): 433-436.
食品从业人员肠道细菌CTX-M 型超广谱β-内酰胺酶的携带状况研究
龙永艳1,2, 倪贤生1, 李端1, 王瑞白2, 陈海婴1, 李娟2, 阚飙2     
1. 南昌市疾病预防控制中心, 江西 南昌 330038;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206
收稿日期: 2016-01-12
作者简介: 龙永艳,女,江西省南昌市人,研究生在读,主要从事微生物肠道病原菌监测和耐药研究工作
作者贡献: 龙永艳：实验与实验设计
阚飙和李娟：实验支持
李端：配合采样
倪贤生和陈海婴：实验支持
通信作者: 李娟,Tel:010-58900763,Email:lijuan@icdc.cn;阚飙,Tel:010-58900703,Email:kanbiao@icdc.cn.
摘要: 目的 调查食品从业人员肠道革兰阴性细菌CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因的携带状况及基因型分布。 方法 选择140名食品从业人员健康体检时的肛拭子标本,用加入头孢曲松钠的营养琼脂平板筛选样本中革兰染色阴性耐药菌,PCR方法扩增blaCTX-M耐药基因,对阳性扩增产物进行测序以明确CTX基因亚型。 结果 140份肛拭样本中有125份样本中分离到头孢曲松钠耐药革兰阴性菌,携带率为89.3%(125/140)。125株耐药菌株中CTX-M的检出率为97.6%;五组CTX中检出率最高的为CTX-M-9组56.0%,其次为CTX-M-1组38.4%,有4株菌同时检测到CTX-M-9组和CTX-M-1组酶。通过序列比对,共检测到9种CTX基因亚型,检出率最高的是CTX-M-14和CTX-M-15。 结论 食品行业从业人员对β-内酰胺类药物普遍存在有抗性的肠道细菌,产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的革兰染色阴性细菌广泛存在,鉴于其工作特点,获得并导致耐药菌传播的风险性很高。
关键词： 食品从业人员     超广谱β-内酰胺酶     耐药菌     CTX-M基因亚型    
Carriage of CTX-M type extended-spectrum β-lactamase in intestinal bacteria isolated from people engaged in food processing
LONG Yong-yan1,2, NI Xian-sheng1, LI Duan1, WANG Rui-bai2, CHEN Hai-ying1, LI Juan2, KAN Biao2     
1. Nanchang Center for Disease Control and Prevention, Nanchang 330038, Jiangxi, China;
2. State Key Laboratory for Communicable Disease Control and Prevention, Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract: Objective To investigate the carriage and genotypes of CTX-M type extended-spectrum β-lactamase (ESBLs) in the intestinal bacteria isolated from people engaged in food processing. Methods A total of 140 rectal swabs were collected from the people engaged in food processing. For each swab, ceftriaxone resistant bacteria were isolated using nutrient agar plateadding ceftriaxone sodium.blaCTX-M genes were detected by PCR for each strains. The genotypes of CTX-M were identified by sequencing of PCR positive amplification products. Results Ceftriaxoneresistant strains were successfully isolated from 125 of 140 stool samples (89.3%, 125/140). Among the 125 strains, 122(122/125, 97.6%) strains carried blaCTX-M genes. The CTX-M-9 group (56.0%, 70/125) was predominant, followed by the CTX-M-1 group (38.4%). Four strains harbored both CTX-M-1 group genes and CTX-M-9 group genes. The predominant genotypes of CTX-Menzyme were CTX-M-14 and CTX-M-15. Conclusion β-lactam resistant strains harboring CTX-M type ESBLs were commonly found from healthy people engaged in food processing. Considering their close contact with food,more attention should be paid to the high risk of spreading these ESBLs resistant bacteria during their working process.
Key words: People engaged in food processing     extended-spectrum β-lactamase     Drug-resistance bacteria     CTX-M genotype    

细菌针对抗生素产生耐药，是当前临床治疗、传染病控制中面临的严峻挑战。携带超广谱β-内酰胺酶、产生抗β-内酰胺类药物的细菌(ESBL)是引起医院感染的常见原因。当前研究和监测主要关注感染患者的病原耐药性以及导致院内感染的临床相关细菌的耐药性。临床和养殖业中抗生素的广泛使用，已使耐药菌株异常增多并扩散，而且一些耐药性可通过耐药基因水平转移引起其他细菌的耐药，可能导致健康人群肠道中自然定居的非致病菌株带有耐药性，且可能引起新的耐药传播扩散。从事食品加工的人群具有更大的扩散耐药细菌的可能。社区健康人群是产超广谱β-内酰胺酶细菌的重要来源[1]，因此研究健康人群正常定植细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药状况有着重要的意义。

产生超广谱β-内酰胺酶是革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素耐药的最主要机制。CTX-M型超广谱β-内酰胺酶是一类能水解青霉素类、头孢菌素类及单环酰胺类抗菌药物的β-内酰胺酶，通常由质粒携带，可快速在不同种属细菌间进行传递[2-3]。近年来CTX-M型超广谱β-内酰胺酶是全球最流行的基因型，根据基因的同源性CTX-M分为五组，即G1、G2、G8、G9和G25基因型[4]，显示了复杂的耐药机制。

我国对食品从业人员健康体检的管理要求，是保障食品安全的一个举措。该人群是否携带超广谱β-内酰胺酶细菌值得关注。本研究对2015年58月在江西省南昌市疾病预防控制中心(CDC)食品从业人员健康体检人群进行抽样检测，了解我国健康食品从业人员的肠道细菌CTX-M型超广谱β-内酰胺酶流行情况。

1 材料与方法 1.1 样本来源

2015年5-8月收集自江西南昌市CDC食品从业人员健康体检肛拭样本140份(人/份)。主要选择从事厨师、洗菜工等餐饮行业人群，调查询问近3个月抗生素使用史，未使用抗生素者纳入研究群体。

1.2 方法 1.2.1 耐药菌株的分离与鉴定

采集健康体检人群肛拭样本，置2 ml无菌生理盐水的试管中，采集的样本2 h内(划线或涂布)接种含4 μg/ml头孢曲松钠(购置中国药品生物制品检定所)营养琼脂平板(抗生素的浓度参照CLSI2013耐药折点浓度)、37 ℃18～24 h培养。挑取平板上耐药的3个形态大小不同的菌落进行革兰染色，阴性的菌落再次接种4 μg/ml头孢曲松钠的营养琼脂平板。分离的菌株(每个样本保留1株单克隆菌)用生物梅里埃API20E细菌鉴定试剂条进行种属鉴定。

1.2.2 DNA模板的制备

挑取24 h内的纯培养物200 μl置入1.5 ml离心管内，100 ℃水浴10 min，12 000 r/min离心5 min，吸取上清。

1.2.3 PCR扩增

CTX-M耐药基因CTX-M基因的引物序列、产物大小及退火温度参考文献[5]。PCR反应体系为50 μl，其中上下游引物 (10 pmol/μl)各2 μl，2×Taq Master Mix(康为世纪) 25 μl，DNA模板3 μl，去离子水调整到50 μl。反应条件: 94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，退火30 s(blaCTX-M-G9退火温度50 ℃，blaCTX-M-G2退火温度58 ℃，blaCTX-M-G1、blaCTX-M-G8和blaCTX-M-G25退火温度55 ℃)，72 ℃延伸1 min，共32个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR仪为德国Sensoquest Labcycler。产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳(成像系统为BioRad公司Gel DOC XR+)。阳性扩增产物进行测序。

1.2.4 序列分析

扩增产物的序列结果用DNAStar 7.1生物软件进行分析，并和GenBank数据库中的blaCTX-M基因进行比对。

2 结果 2.1 年龄和性别

共有140名研究对象纳入本次研究，其中男性49名，女性91名，年龄16~63岁，平均31.1岁。

2.2 耐药菌株分离结果

140份肛拭标本接种含头孢曲松钠的抗生素平板，均有菌落生长。每份标本挑取耐药的3个形态大小不同的菌落进行革兰染色，将阴性的菌落再次接种含头孢曲松的营养琼脂平板。共有125份标本分离到革兰染色阴性菌。从业人员携带耐头孢曲松钠革兰染色阴性菌的阳性率为89.3%。其中革兰阴性菌分离率女性为91.2%(83/91)，男性为85.7%(42/49)，经χ2检验，差异无统计学意义(P=0.316)，按年龄分两组,16~40岁革兰阴性菌分离率91.3%(95/104),41~70岁革兰阴性菌分离率83.3%(30/36)，经χ2检验，差异无统计学意义(P=0.304)。从每份样品中随机挑取1株革兰染色阴性菌株进行种属鉴定，菌株构成比见表 1。

表 1 头孢曲松耐药革兰染色阴性菌株的分布 Table 1 Distribution of ceftriaxone resistant gram negative bacteria
菌名菌株数构成比(％)
大肠埃希菌10886.4
肺炎克雷伯菌129.6
弗劳地柠檬酸杆菌21.6
伤口埃希菌10.8
弗格森埃希菌10.8
奇异变形杆菌10.8
合计125100
表选项
2.3 CTX-M基因扩增检测和基因型的鉴定

对125株耐头孢曲松的革兰阴性菌，进行CTX-M基因PCR检测，引物用于扩增五组CTX-M基因，除3株菌(2株弗劳地柠檬酸杆菌，1株大肠埃希菌)扩增阴性，其余菌株均扩增阳性，阳性检出率为97.6%(122/125)。其中，CTX-M-G1组检出率为38.4%(48/125)，CTX-M-G9组检出率为56.0%(70/122)，CTX-M-G1组和CTX-M-G9组同时检出率为3.2%(4/125)。CTX-M-G2、CTX-M-G25和CTX-M-G8组引物扩增均为阴性。对扩增产物进行测序，通过序列测定比对，得到CTX-M亚型及在各种属菌株中的分布，见表 2。

表 2 CTX-M型基因在分离菌株中的分布 Table 2 Distribution of CTX-M genes in isolated strains
菌型CTX-M基因型总计
M55M3M15M64M14M27M24M98M65M55+M14M55+M27M15+M14
大肠埃希菌 1541813819215211107
弗格森埃希菌1000000000001
肺炎克雷伯菌14401100100012
伤口埃希菌 0000001000001
奇异变形杆菌0000000010001
合 计1782213920317211122
表选项
3 讨论

本研究对食品从业人员健康体检(检测时无腹泻，且3个月内未使用抗生素)粪便标本进行了耐头孢曲松钠药物革兰染色阴性细菌的培养分离、并进一步鉴定其CTX-M型ESBLs基因。所有检测标本均发现耐头孢曲松的菌落生长，与采样人群的性别、年龄无关，其中革兰阴性耐药菌分离率与性别、年龄的差异无统计学意义。经随机挑选菌落进行染色鉴定，发现89.3%的食品从业人员携带耐头孢曲松的革兰阴性菌，这些菌中绝大多数携带CTX-M型ESBLs的基因，只有2株弗劳地柠檬酸杆菌、1株大肠埃希菌未检测到CTX-M型ESBLs基因。此3株菌株有可能携带其他型ESBLs基因，有待进一步研究。

以往针对患者和致病细菌的产超广谱β-内酰胺酶进行监测和研究，但针对正常人群在无感染和表现疾病时是否仍携带抗β-内酰胺药物的定植细菌研究较少。对于健康体检人群的携带耐药菌株的监测，大多是先培养获得菌株后，再对分离株进行耐药状况和相应基因的检测[6-7]。本研究将粪便标本直接经含有头孢曲松的营养琼脂培养基进行耐药菌株的筛检，主要观察非腹泻人群中携带耐头孢类革兰阴性菌及其CTX-M型ESBLs基因的状况。监测结果显示调查人群非腹泻状态下依然携带高水平耐头孢类药物菌株。在另外一项针对健康人群携带CTX-M β-内酰胺酶的大肠埃希菌研究中[8]，也发现有50.5%的携带率。

本研究中对加有抗生素平板上生长的菌落进行了随机挑选，对菌落携带CTX-M基因进行了PCR筛查和测序分型。发现携带CTX-M型ESBLs基因的肠杆菌在调查人群中携带率非常高，其亚型主要为CTX-M-G9和CTX-M-G1组，而且发现少量菌株中同时检出CTX-M-G1组和CTX-M-G9组酶。进一步对不同CTX-M基因型的分布检测，基因型别较多，共检测到9种基因型，而且在4株菌中分别检测到2种基因型共存。提示健康人群中非致病肠杆菌携带复杂的CTX-M耐药基因。有报道临床来源大肠埃希菌的CTX-M-15和CTX-M-14检出率最高[9]，另一项监测发现临床分离的志贺菌中检出的都为CTX-M-14[10]，另外，从致病菌的传播链上，有报道从健康家禽和家畜中分离的大肠埃希菌CTX-M-14和CTX-M-55检出率最高[11]。临床检出菌和动物来源菌中有着类似的CTX-M流行亚型，提示从养殖、健康人群和临床病例群体中，应存在CTX-M耐药基因的传递。

CTX-M型ESBLs常位于质粒和转座子上，易在不同宿主间传播[11]。且常与sul、qnr、armA等其他类型耐药基因聚集成簇，介导对氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类等抗菌药物耐药[2-3]。有研究发现人和零售鸡肉类食品携带相同类型的ESBLs耐药基因[3]，并显示食品加工人员和肉类食品所携带的ESBLs基因可以通过食物中的微生物造成扩散[12]。耐药菌可通过食品加工环节的污染造成耐药菌扩散，一方面可因食物加工过程中获得耐药菌，另一方面可以造成耐药菌的传播。本研究选择健康体检人群为食品从业人员，主要为厨师、洗菜工等，他们与家禽、家畜等肉类和蔬菜接触频繁，相对容易获得产ESBLs的抗性菌株，更易传播抗性菌株。因此，监测食品从业人员抗生素耐药菌株、尤其是肠道非致病的菌株，在食品安全管理以及防止耐药菌株扩散等方面，有着积极的意义。

本次研究使用的普通琼脂平板可增殖多种细菌。主要选择加入头孢曲松的琼脂平板分离耐药菌株，并随机挑取了1株革兰阴性耐药菌(鉴定均为肠杆菌)。健康者肠道中可能存在多种耐CTX-M型ESBLs的细菌。在以后的研究中将进一步利用不同培养鉴定方法，从挑选细菌的数量和细菌种类的广度上对标本耐药菌进行更详细的筛检。

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