疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (6): 471-476

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刘海灿, 赵丽丽, 赵秀芹, 万康林
LIU Hai-can, ZHAO Li-li, ZHAO Xiu-qin, WAN Kang-lin
耐多药结核分枝杆菌二线药物耐药相关基因的分析
Analysis on second line drug resistance related genes in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates
疾病监测, 2016, 31(6): 471-476
Disease Surveillance, 2016, 31(6): 471-476
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.06.007

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收稿日期：2015-11-25
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刘海灿, 赵丽丽, 赵秀芹, 万康林. 耐多药结核分枝杆菌二线药物耐药相关基因的分析[J]. 疾病监测, 2016, 31(6): 471-476.
LIU Hai-can, ZHAO Li-li, ZHAO Xiu-qin, WAN Kang-lin. Analysis on second line drug resistance related genes in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(6): 471-476.
耐多药结核分枝杆菌二线药物耐药相关基因的分析
刘海灿, 赵丽丽, 赵秀芹, 万康林     
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 感染性疾病诊治协同创新中心, 北京 102206
收稿日期: 2015-11-25
基金项目: 国家"十二五"科技重大专项(No.2013ZX10003006-002)
作者简介: 刘海灿,男,河南省漯河市人,博士/助理研究员,主要从事结核分枝杆菌基因多态性及基因组学研究工作
通信作者: 万康林,Tel:010-58900776,Email:wankanglin@icdc.cn.
摘要: 目的 分析临床分离的耐多药结核分枝杆菌的3种二线抗结核药物[卷曲霉素(CAP)、卡那霉素(KAN)和氧氟沙星(OFX)]耐药相关基因的分子特征,及其与不同Spoligotyping基因型的相关性。 方法 对临床分离的128株耐多药结核分枝杆菌进行Spoligotyping分型,并对其5个基因区域(tlyA、eis、rrs、gyrA和gyrB)进行聚合酶链反应测序和分析。 结果 在60.0%(6/10株)的CAP耐药和0.8%(1/118株)的CAP敏感菌株中存在rrs-A1401G突变;在84.6%(11/13株)KAN耐药菌株在rrs基因或eis启动区存在突变,其中有53.8%(7/13株)存在rrs-A1401G突变,23.1%(3/13株)存在eis-C(-10)A突变,7.7%(1/13株)存在eis-G(-14)T突变,3.5%(4/115株)的KAN敏感菌株存在eis-C(-12)T突变。在83.3%(53/60株)的OFX耐药菌株中存在gryA基因突变,最常见的突变发生在第94位密码子(37/60株,61.7%),其次为第90位密码子(12/60株,20.0%)。还有5.0%(3/60株)的菌株存在gryB基因突变。共有84.4%(108/128株)的菌株被鉴定为北京基因型,没有发现菌株的基因型与耐药相关突变位点间存在关联性。使用核酸测序检测CAP、KAN和OFX耐药的敏感度和特异度分别是60.0%和99.4%、84.6%和99.4%、90.0%和100.0%。 结论 耐多药菌株中最常见的基因突变位点是:rrs-1401、eis-10,以及gyrA-94、-90和-91。这些结果为结核分枝杆菌相关药物耐药性的快速检测提供了良好的基础。
关键词： 结核病     耐多药     北京基因型     分子特征    
Analysis on second line drug resistance related genes in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates
LIU Hai-can, ZHAO Li-li, ZHAO Xiu-qin, WAN Kang-lin     
State Key Laboratory for Communicable Disease Control and Prevention, Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract: Objective To investigate the molecular characteristics of clinical multi-drug resistant Mycobacterium (M.) tuberculosis (MDR-TB) isolates to three second line drugs (capreomycin, kanamycin andofloxacin) and the association with the Spoligotyping genotypes of M. tuberculosis in China. Methods A total of 128 MDR-TB were selected for Spoligotyping, then PCR and sequencing were conducted for the five selected genes (tlyA, eis, rrs, gyrA and gyrB) associated with capreomycin, kanamycin andofloxacin resistances. Results rrs-A1401G mutation occurred in 60.0% of the capreomycin resistant isolates (6/10) and 0.8% of the capreomycin sensitive isolates (1/118). For the kanamycin resistant isolates 84.6% had rrs or eis promote region mutations (11/13), in which 53.8% (7/13) had rrs-A1401G mutation, 23.1% (3/13) had eis-C(-10) A mutation, 7.7% (1/13) had eis-G(-14)T mutation, while 3.5% of the kanamycin sensitive isolates (4/115)had eis-C(-12)T mutation. For of loxacin resistant isolates, 83.3% (53/60) had gyrA mutation and 5% (3/60) had gryB mutation, the most frequent mutation in gryA gene was at the codon 94(37/60, 61.7%) and followed by codon 90(12/60, 20.0%). For all the selected isolates, 84.4% (108/128) were identified as Beijing genotype isolates, and no relationship was found between Spoligotyping genotypes and drug resistance phenotypes. The sensitivity and specificity for sequencing to identify the susceptibility to capreomycin, kanamycin andofloxacin were 60.0% and 99.4%, 84.6% and 99.4%, 90.0% and 100.0%, respectively. Conclusion The most frequent occurred mutation loci in the selected genes were rrs-1401, eis-10, and gyrA-94, -90, -91, which can be used as evidence for the rapid detection of drug susceptibility of M. tuberculosis.
Key words: Tuberculosis     Multi drug resistance     Beijing genotype     Molecular characteristic    

随着直接观察(或面视)下的短程化疗(DOTs)及其他相关结核病(tuberculosis，TB)控制策略的制订和执行，TB在全球迅速扩大流行的态势得到一定程度的遏制[1]，但是，TB仍然是全球公共卫生面临的巨大挑战。据世界卫生组织(WHO)估计全球每年约有900万新发TB病例，其中我国约占全球新发病总人数的10.9%，每年约有98万的新发患者，仅次于印度在全球高TB负担国家中排第2位[2]。近年来，耐药性结核病(drug-resistant tuberculosis,DR-TB)，特别是多耐药(multidrug-resistant，MDR)和广泛耐药性(extensively drug-resistant，XDR)TB的出现和传播，给TB防控工作带来了更大的挑战。我国20072008年的全国DR-TB基线调查发现，约8.3%的TB为MDR-TB，而诊断为MDR-TB的患者中约8.0%为XDR-TB患者[3]。

DR-TB通常由于不规范的抗TB治疗或直接感染耐药性菌株引起，正确及时的对菌株进行药物敏感性检测，对于实时调整治疗措施以及控制DR-TB的传播具有重要意义[4]。由于结核分枝杆菌生长缓慢，传统药物敏感性检测方法耗时费力，需要发展新的分子生物学方法提高药物敏感性检测的时效性。既往的研究发现，不同地区的菌株中存在不同的耐药相关基因突变位点，但不同的研究都认为tlyA、eis、rrs、gyrA和gyrB 5个基因中的突变与结核分枝杆菌的二线药耐药相关[5-7]。而且在我国主要流行的北京基因型菌株被认为可能具有更强的传播能力和获得耐药突变的能力，但在不同的地区也具有不同的耐药相关突变类型[8]。

尽管在我国已经有一些MDR或XDR-TB分子特征相关的研究报告，但仅限于某个地区来源的少量菌株对其中特定的基因位点进行了研究[9-11]。既往研究认为卷曲霉素耐药与rrs基因中的一个516 bp的区域以及整个tlyA基因中的突变有关，卡那霉素耐药多与rrs和eis基因突变有关，而gryA和gryB两个基因中的喹诺酮耐药决定区与大部分的氧氟沙星耐药相关。因此，本研究将使用全国不同地区来源的128株MDR-TB菌株对其中的tlyA、eis、rrs、gyrA和gyrB 5个二线抗TB药物耐药相关基因位点进行研究，并将研究耐药表型与Spoligotyping基因型之间的关系。

1 材料与方法 1.1 菌株来源

本研究中使用的128株MDR-TB菌株，来自于全国6个不同的省(直辖市、自治区)的结核病医院，并经过流行病学调查，菌株培养来源的TB患者之前没有流行病学关联。菌株来源详细信息见表 1。另外，结核分枝杆菌H37Rv株[购自中国食品药品检定研究院，由中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所结核病室保藏]在本研究中被作为参考菌株。

表 1 128株MDR-TB菌株的地区来源 Table 1 Sources of 128 MDR-TB isolates
省(直辖市、自治区)菌株数(株)
福建21
贵州20
辽宁18
陕西23
上海22
西藏24
合计128
表选项
1.2 药物敏感性检测

本研究中所有菌株的药物敏感性检测，均使用比例法在改良罗氏培养基上按照标准操作规程进行[12]。不同药物使用的工作浓度见表 2。依据检测结果和WHO相关定义标准，如果仅对异烟肼和利福平耐药则被认为是MDR-TB菌株；如果在耐异烟肼、利福平和氧氟沙星的同时，又对卷曲霉素和卡那霉素两种的任一种耐药则被认为是XDR-TB菌株。

表 2 药物敏感性检测使用的不同药物工作浓度 Table 2 Antibiotic concentrations used for drug susceptibility test
药物名称浓度(μg/ml)
异烟肼(INH)0.2
利福平(RIF)40.0
卷曲霉素(CAP)40.0
卡那霉素(KAN)30.0
氧氟沙星(OFX)2.0
表选项
1.3 基因组DNA提取

在罗氏培养基上进行增菌培养，用接种环取一环处于对数生长期的结核分枝杆菌菌落，置于含有400 μl TE缓冲液的螺口管中重悬，再使用金属浴80 ℃ 1 h灭活，离心收集上清液即为需要的基因组DNA模板[13]，-20 ℃保存备用。

1.4 基因分型

采用标准的Spoligotyping操作方法[14]，对研究中选定的菌株进行分子分型鉴定，获得实验结果后，与SpolDB 4.0数据库进行比对分析确定菌株的Spoligotyping基因型别[15]。

1.5 基因扩增与测序

使用NCBI网站公布的结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组序列(序列编号：NC_000962)作为模板，设计5个基因(tlyA、eis、rrs、gyrA和gyrB)的扩增和测序引物，见表 3，并将其作为参考序列研究不同菌株、不同基因位点的变异信息。在30 μl 聚合酶链反应(PCR)体系中，包括15 μl 2× Taq master mix(TaKaRa)、1 μl上、下游引物(5 μmol/L)和1 μl基因组DNA，余下体积用双蒸水(ddH2O)补足。在PCR过程中，首先95 ℃预变性5 min，再用94 ℃变性30 s、60 ℃复性30 s和72 ℃延伸45 s，扩增35个循环，扩增产物送北京擎科兴业公司纯化后进行核酸序列测定，核酸序列比对使用Clustal W和Bio Edit等软件完成[16-17]。

1.6 统计学分析

为研究样品菌株中北京基因型与非北京基因型菌株之间耐药发生率的差异，使用SPSS 16.0软件和χ2检验进行统计学分析，P＜0.05作为差异有统计学意义的检测阈值。

2 结果 2.1 药物敏感性检测结果

在所有MDR-TB菌株中，有46.9%(60/128)的菌株对氧氟沙星(OFX)耐受、 7.8%(10/128)对卷曲霉素(CAP)耐受，10.2%(13/128)对卡那霉素(KAN)耐受，其中有3.9%(5/128)的菌株对本研究中的3种二线抗TB药物全部耐受，还有50.8%(65/128)的菌株对3种药全部敏感，在全部菌株中有10.2%(13/128)为XDR-TB菌株。

2.2 Spoligotyping分型

经过Spoligotyping实验和与SpolDB 4.0数据库比对后发现，128株MDR-TB菌株中有108株(84.4%)为北京基因型菌株，其余的菌株分别属于T(9株)、H(4株)和MANU2(2株)基因型以及未在SpolDB 4.0数据库中收录Spoligotyping型别(5株)。

2.3 CAP耐药相关突变

在128株样品菌株中，共有10株对CAP耐药，其中还有7株同时对KAN耐药。经分析发现，在全部128株临床菌株的tlyA基因中均存在CTA11CTG突变，与CAP耐药不存在关联性；在rrs基因中发现A1401G突变存在于6株CAP耐药和1株CAP敏感菌株中，见表 4。耐药相关基因测序对CAP敏感度和特异度分别为60.0%和99.4%。

2.4 KAN耐药相关突变

在128株样品菌株中，共有13株对KAN耐药，通过对rrs和eis启动区的序列分析发现，有84.6%(11/13株)KAN耐药菌株在rrs基因区或eis启动区存在基因突变。其中约有53.8%(7/13株)的菌株在rrs基因中存在A1401G突变；在eis启动区，有23.1%(3/13株)的耐药菌株存在C(-10)A突变，7.7%(1/13株)存在G(-14)T突变。另外，还有4株KAN敏感菌株在eis启动区存在C(-12)T突变，见表 4。耐药相关基因测序对KAN耐药的检测敏感度和特异度分别为84.6%和99.4%。

2.5 OFX耐药相关突变

经过对gryA和gryB基因序列进行后分析发现，在60株OFX耐药的菌株中，约83.3%(53株)的菌株在gryA基因中存在突变，其中最常见的突变发生在第94位密码子位置(37/60，61.7%)，其次为第90位密码子位置(12/60，20.0%)。而在gryB基因分别在3株菌株中检测到3个突变位点，分别是GAC461AAC、ACC500CCC和GCG504GTG。所有OFX敏感菌株中均未在这两个基因中检测到基因突变信息(表 4)。耐药相关基因测序对OFX耐药检测的

2.6 耐药发生率与基因型的关系

结合菌株耐药表型、基因突变信息和Spoligotyping分型结果，使用SPSS 16.0软件进行χ2分析。经统计分析发现，Spoligotyping北京基因型和非北京基因型菌株之间的耐药和基因突变发生率差异无统计学意义。

表 3 基因PCR扩增和测序的引物 Table 3 Primers used for PCR and sequencing
引物名称引物序列(5′~3′)基因组中的位置(1)产物大小(bp)
tlyA1-FAGG CGC ACG AGG TGT TGT TG1917883~1918409527
tlyA1-RAAC GAC AGG TCG GCC ACT ACC AGG T
tlyA2-FATG TCG GAT ACG GCC AGC TG1918274~1918828555
tlyA2-RACT TTT TCT ACG CGC CGT GC
eis-FGCG TAA CGT CAC GGC GAA ATT C2714911~2715477567
eis-RGTC AGC TCA TGC AAG GTG
rrs-FGTC CGA GTG TTG CCT CAG G1473003~1473518516
rrs-RGTC AAC TCG GAG GAA GGT GG
gyr A-FTCG ACT ATG CGA TGA GCG TG7387~7801415
gyr A-RGGT AGC ACC GTC GGC TCT TG
gyr B-FCCG CTG TGA TCT CGG TGA AG6303~7077775
gyr B-RAGA CCC TTG TAC CGC TGA ATG
注：(1) 基因组中的位置依据参考序列H37Rv标准株(NC_000962)全基因组序列确定。
表选项
表 4 二线药耐药相关突变信息 Table 4 Second line drug resistance associated mutations
药物菌株数基因名核酸变异氨基酸变异突变菌株数突变菌株占比(%)协同变异位点
CAP 10tlyANM(1)NM10100.0-
rrsNMNM440.0-
A-GA(1401)G660.0-
KAN 13eisNMNM969.2-
G-AG(-10)A323.1-
C-TC(-14)T17.7-
rrsNMNM646.2-
A-GA1401G753.8-
OFX 60gyrANMNM711.7-
GCC-TCCAla74Ser11.7Asp94Gly(gyrA)
GAC-GGCAsp89Gly11.7
GCG-GTGAla90Val1118.3
GCG-GTGAla90Val11.7Asp94Ala(gyrA)
TCG-CCGSer91Pro46.7-
GAC-AACAsp94Asn46.7-
GAC-CACAsp94His23.3-
GAC-GCCAsp94Ala711.7-
GAC-GCCAsp94Ala11.7Thr500Pro(gyrB)
GAC-GGCAsp94Gly1525.0-
GAC-GGCAsp94Gly11.7Ala504Val(gyrB)
GAC-TACAsp94Tyr58.3-
gyrBNMNM5794.9-
GAC-AACAsp461Asn11.7-
ACC-CCCThr500Pro11.7Asp94Ala(gyrA)
GCG-GTGAla504Val11.7Asp94Gly(gyrA)
注：(1) NM：无突变。
表选项
3 讨论

我国在全球TB高负担国家中列居第2位[2]，而每年有大量的MDR-TB患者，但许多地区菌株的耐药相关分子特征仍不清楚。本次研究使用6个省(直辖市、自治区)来源的128株MDR菌株进行了2种一线抗结核药物(异烟肼、利福平)和3种二线药物(CAP、KAN和OFX)的药物敏感性实验，并对菌株基因组中5个与选定的3种二线耐药相关基因中的突变特征进行了分析。在既往的研究报道中，我国MDR-TB中的XDR-TB发生率在6.3%~18.7%之间[11, 18-20]，在本次研究中，有10.2%(13/128)的MDR-TB菌株被鉴定为XDR-TB，与以往研究结果一致。另外，约46.9%(60/128)的菌株表现为OFX耐药，提示在MDR-TB菌株中，OFX耐药的出现可能是菌株发展为XDR-TB的前期步骤，为控制XDR-TB的发生和传播，需要在TB监测工作中加强对相关耐药发生状态的监测措施。

多重耐药结核杆菌中CAP耐药通常和KAN耐药共同出现[21-23]，约51%~96%的CAP耐药菌株，同时具有rrs基因的A1401G突变[23-24]。本研究发现的10株CAP耐药的菌株中，仅有3株(30.0%)为CAP单耐药，其余7株(70.0%)均为CAP和KAN共同耐药，60.0%(6株)的CAP耐药菌株和53.8%(7/13株)的KAN耐药菌株均具有rrs基因的A1401G突变，提示该突变位点可能与CAP和KAN的共同耐药相关。在与CAP耐药的tlyA基因序列中未发现突变位点，与既往研究报道不一致[23-24]，可能是因为本研究中CAP耐药菌株太少，导致未能检测到相关突变信息。

rrs基因中的3种单碱基突变(A1401G、C1402T和G1484T)被认为与KAN的耐药相关[21, 24]，但在本次研究的菌株中仅在rrs基因序列中发现了A1401G突变。另外eis基因启动区的碱基突变通常被认为与低水平的KAN耐药相关，最常见的突变类型G(-10)A和C(-14)T在本研究的菌株中均有发现，而被认为可能与KAN敏感相关的一个突变位点[C(-12)T]同样存在[25]。在本次检测的13株KAN耐药的菌株中，有11株(84.6%)具有rrs或者eis启动区突变。

通过对gryA和gryB两个基因中的喹诺酮耐药决定区(QRDR)的测序分析发现，约88.3%的OFX耐药与gryA基因的突变相关，还有5.0%与gryB基因突变有关(表 4)。在gryA基因中最常见的突变发生在第94或第90位密码子，其次是第91位密码子，同时在第95位密码子存在可能与菌株进化相关的突变，与之前的研究一致[11, 26-28]。虽然有研究认为gryB基因突变通常与gryA基因突变同时存在，且可能与喹诺酮类药物的高水平耐药相关[28]，但近年也有单独的gryB基因突变的研究报告[29-30]，在本研究中发现有3个菌株存在gryB基因突变。但是，仍有部分OFX耐药的菌株不存在gryA或gryB基因突变，提示可能存在其他耐药相关基因突变或者其他耐药形成机制，需要更深入的研究。

尽管本研究中，耐药相关基因测序对CAP、KAN和OFX耐药检测的敏感度分别为60.0%、84.6%和90.0%，特异性分别为99.4%、99.4%和100.0%，与之前的研究报道一致[10-11, 21, 31]，但既往研究中发现的高频突变并未在菌株中发现，可能是由于本研究中使用的菌株仍然较少(CAP耐药10株，KAN耐药13株)造成的。另外，部分菌株的耐药不能用已有的基因突变特征进行解释，可能存在其他耐药相关基因或者其他的耐药形成机制，如药物的主动外排等，需要进行更深入的研究。

本研究对全国多个省(直辖市、自治区)来源的MDR-TB菌株进行了Spoligotyping基因分型，并对其5个二线抗结核药物耐药相关基因区(tlyA-CAP、eis-KAN、rrs-CAP和KAN以及gryA和gryB-OFX)进行了PCR扩增和核酸测序分析。使用的菌株中有84.4%(108/128)属于结核分枝杆菌北京基因型菌株,且菌株的Spoligotyping基因型与耐药表型之间没有关联性(P＜0.05)。通过耐药相关基因区测序分析，对于检测相关药物的耐药具有很高的特异性和敏感性，因此相关突变位点可能被用作结核分枝杆菌耐药快速检测的分子标记，用来发展结核分枝杆菌耐药的快速检测方法。但仍有部分耐药表型不能用现有突变位点解释，需要更深入的研究。

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