猪霍乱沙门菌(Salmonella Choleraesuis)是引起2~4月幼龄猪副伤寒的主要病原菌，对人具有高度侵袭性，可导致发热、菌血症等全身性感染症状^[1-2]。在发达国家，猪霍乱沙门菌感染较少见，但在发展中国家，如非洲，约0.3%的发热病例由非沙门菌感染引起^[3-4]，而猪霍乱沙门菌为血源性沙门菌感染的5种常见血清型之一，在免疫系统缺陷患者(如HIV感染患者)中，该菌感染常见，并常导致患者死亡。我国也有猪霍乱沙门引起败血症的报道^[5-6]，但缺少系统的血源性感染的数据。另外人感染猪霍乱沙门菌后，临床表现不典型，感染后主要表现为高热，与由伤寒及副伤寒沙门菌引起的肠热症及其他引起人类发热症状的病原菌(统称非沙门菌)在临床表现上难以区分，如布鲁氏菌病(布病)、钩端螺旋体病、斑疹伤寒、侵袭性金黄色葡萄球菌感染等。

目前，猪霍乱沙门菌的诊断主要依靠病原学培养和血清学检测。病原学分离培养及血清型确认所需时间较长(至少3 d)，实验室中血清学诊断主要依靠凝集反应和酶联免疫吸附试验。而这些方法的特异性及敏感性均较低。同时由于猪霍乱沙门菌与丙型副伤寒沙门菌的抗原式相同，必须进行特殊生化反应予以鉴别^[7-8]，从而增加了诊断的难度及复杂度，延长了确诊时间，有可能造成疾病治疗的延误。因此，对猪霍乱沙门菌的快速灵敏诊断一直是传染病检测、监测和应急中亟待解决的问题。

已有报道基于核酸检测猪霍乱沙门菌感染的方法^[9-10]，但这些研究均以DNA为模板，不能排除死菌或残留DNA引起的假阳性结果。本研究根据猪霍乱沙门菌特异基因SC1242设计实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,rRT-PCR)引物，建立了相应的反应体系，并利用常见沙门菌血清型菌株、近缘肠道菌株及引起发热症状的其他病原，筛选到了具有高特异性、高灵敏性的rRT-PCR猪霍乱沙门菌检测引物,期望能够减少假阳性反应，达到快速检测猪霍乱沙门菌的目的。

123株实验用菌株均来自中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所(表 1)，均经过生化及血清型(群)确认，主要包括沙门菌属菌株及非沙门菌属菌株，其中猪霍乱沙门菌20株，丙型副伤寒沙门菌20株，汤姆逊沙门菌、鼠伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌和汤姆逊沙门菌各8株，甲型副伤寒沙门菌7株，肠炎沙门菌6株，纽波特沙门菌10株及其他6株常见沙门菌株，其他肠道常见病原菌(志贺菌、致泻性大肠埃希菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌)及引起发热并可在血液标本中分离到的肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、脑膜炎奈瑟菌、立克次体、布鲁氏菌等菌株。

前期利用R脚本，通过比对GenBank中所有猪霍乱沙门菌已知序列，获得它们共有的基因序列(core genome)后再与其他血清型沙门菌(pan genome)及人类基因组(人类EST库)进行比对，进而获得猪霍乱沙门菌特有而与人类及其他沙门菌无共有序列的特异基因SC1242，该基因编码一个未知功能的假想蛋白。在分析中判定基因有无的标准为：经Alignment后，基因序列一致性若 ＜50%该基因全长(利用该阈值可尽量减少初筛基因的数量，有利于减少后续实验室验证的工作量)，则认为该基因不存在(无)，若≥50%，则认为该基因存在(有)。以该基因为靶点，根据GenBank中猪霍乱沙门参考株SC-B67(NC_006905.1)的基因序列，使用软件Primer Premier 5.0设计针对该基因的rRT-PCR引物：SC1242F: 5′-ACG TTC GGG TTC AGG TCA T-3′，SC1242R: 5′-TAC CGT GCC TCC GGT TTA T-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以提取的病原菌RNA为模板，模板量为1μl，使用One Step SYBR Primerscript RT-PCR Kit Ⅱ(TaKaRa)进行RNA反转录和核酸扩增。使用CFX96荧光PCR仪，扩增条件为42 ℃ 30 min；94 ℃ 30 s，60 ℃15 s，共45个循环。Ct值≤35的扩增结果判定为阳性。以细菌数量的对数值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制rRT-PCR标准曲线方程。

从平板上挑取猪霍乱菌株单克隆培养过夜，按1∶100活化培养至 A₆₀₀=0.6左右收集菌液，使用RNeasy Minikit(QIAGEN公司)试剂盒提取细菌总RNA，RNA提取操作步骤均严格按照说明书进行。纯菌RNA提取测定浓度后，对总RNA 进行系列稀释，最后选取100、50、25、10、5、1 pg/μl；100、50、25、10、5、1 fg/μl 共12个浓度梯度，从各浓度各取1 μl作为检测样本，检测rRT-PCR引物的灵敏度。

取新鲜培养4~6 h细菌(最终菌落计数为4.5×10⁸ cfu/ml)，10倍梯度系列稀释为10¹~10⁶ cfu/ml，取各稀释度菌液2 ml分别与同体积新鲜人抗凝血混匀，室温放置1 h后，作为全血模拟标本。利用QIAamp UCP PurePathogen Blood field test Kit(QIAGEN公司)对上述模拟标本进行猪霍乱沙门菌RNA的提取，具体操作步骤严格按照说明书进行。同时以不加猪霍乱沙门菌的血液作为阴性对照(NC)平行进行RNA提取。

采用热裂解法制备模板。取纯菌培养的新鲜菌落2~3个，悬浮于50 μl纯水中，100 ℃ 煮沸10 min裂解细菌，然后 4 ℃ 13 000 r/min离心5 min，取上清液用做PCR反应模板。

针对通过序列比对获得的基因SC1242，设计合成普通PCR引物，选择我国不同时间及地点分离的20株猪霍乱沙门菌进行全基因扩增，结果均得到294 bp大小的目的条带。随机选择6个PCR产物进行序列测定，经BLAST比对，一致性为100%，说明该基因在猪霍乱沙门菌中高度保守。同时利用25种123株血清型沙门菌及非沙门菌进行扩增，结果均为阴性，进一步说明SC1242为猪霍乱沙门菌的特异基因(表 1)。结果表明SC1242为猪霍乱沙门菌特异而保守的基因，适于作为发展特异性核酸诊断的靶标。利用Primer Premier 5.0设计针对该基因的rRT-PCR引物，以提取纯化猪霍乱沙门菌标准株CMCC50018的总RNA为模板，使用One Step SYBR Primerscript RT-PCR Kit Ⅱ(TaKaRa)进行RNA反转录和核酸扩增，确定反应条件(具体参数见方法1.2)。

本研究对25种123株细菌进行rRT-PCR检测，其中20株猪霍乱沙门菌均为阳性(表 1)。沙门菌属其他14个血清型81株菌均为扩增阴性。其他常见腹泻病原(志贺菌、致泻性大肠埃希菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌)扩增阴性。临床其他常见的发热病原菌(肺炎链球菌、钩端螺旋体、脑膜炎奈瑟菌、立克次体、金黄色葡萄球菌、布鲁氏菌)均扩增阴性，说明本研究筛选到的rRT-PCR引物具有较高的菌种和血清学特异性，特异性达100%。

以倍比稀释的纯RNA为模板，检测rRT-PCR反应的敏感性，进行3次独立重复实验，结果一致(图 1A)。 rRT-PCR检测SC1242基因的敏感性为50 fg/反应，约为96个拷贝/反应。以模板RNA拷贝数的对数为横轴，以Ct值为纵轴，得到标准曲线方程为ｙ=-2.9119x+27.012，R²=0.9943(图 1B)，说明引物扩增效率较高。

图 1 纯菌样本中猪霍乱沙门菌rRT-PCR反应敏感性 Figure 1 Sensitivity of rRT-PCR in detecting SC1242 gene in pure strain specimen

图选项

把新鲜血液与不同浓度的猪霍乱沙门菌混匀，室温放置1 h后,进行病原微生物RNA的提取，最终提取的RNA溶解到50 μl不含RNase的无菌纯水中，取其中5 μl作模板，进行rRT-PCR。同时，取系列稀释菌液进行菌落计数，测定模拟标本中准确细菌含量。然后进行rRT-PCR敏感性检测，见表 2。可以看出rRT-PCR对血液样本的最低检测限为90 cfu/ml。该实验结果提示SC1242基因可能在体内进行转录表达。有关该基因在体内的真实转录表达情况，将在下一步研究中采集猪霍乱感染患者的血液标本进行转录组检测分析。

考虑到实际样本检测中经常遇到分离菌株后，需要进行后续繁琐的生化鉴定及血清凝集工作，不仅耗费人力、物力、财力，而且需时较长 (2~7 d)，为尽快得到菌株鉴定结果，笔者尝试用粗提RNA为模板进行rRT-PCR检测，结果10株猪霍乱沙门菌均阳性，而其他肠道致病菌菌株均阴性，且反应Ct值均 ＜20(Ct值15~19，结果未显示)。同时利用rRT-PCR引物不经反转录反应直接进行DNA定量扩增，结果Ct值在20~23之间，比rRT-PCR反应的Ct值平均减少4左右，上述结果说明以直接水煮核酸为模板，可以进行有效的rRT-PCR扩增检测，且检测敏感性较以DNA为模板的荧光PCR(染料法)提高16倍左右，同时也说明SC1242基因能够在体外进行转录表达。该结果还提示，在发展针对某靶基因的核酸检测方法时，检测其转录产物-多拷贝RNA(在有转录的情况下)比仅检测单一拷贝的DNA分子，将明显提高检测反应的灵敏度。

猪霍乱沙门菌与其他沙门菌相比较，具有较高的侵袭性，更容易引起败血症和迁徙性病灶，给人和动物造成重大危害。传统对猪霍乱沙门菌的诊断主要依靠病原学培养和血清学检测，但是存在时间长，特异性和灵敏度低等问题。陈弟诗等^[9]针对invB全基因设计引物，通过PCR成功地从猪霍乱沙门菌C500标准株和分离株中扩增出目的条带，5个非沙门菌无特异性扩增。但是文中也提到引物基因与GenBank中序列号为NC 006905、AE008832、STU08279、AE017220的沙门菌invB基因比较后，同源性分别为100.0％、99.8％、99.0％、100.0％，并不能直接区分猪霍乱沙门菌与其他血清型沙门菌，还需血清学凝集实验进一步证实。

本实验在猪霍乱沙门菌特异的SC1242基因保守区域设计rRT-PCR引物，经过试验菌株的扩增筛选，最终获得了特异性高、灵敏度好的rRT-PCR引物，能把猪霍乱沙门菌与沙门菌属中其他常见的沙门菌血清型区分开，达到了猪霍乱沙门菌血清型快速鉴定的目的。并且在常见食源性致病菌如副溶血弧菌、致泻性大肠埃希菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌等中无扩增，具有潜在应用于食源性致病菌快速诊断的价值。由于前期生物信息学分析工作开展较早，未涵盖2012年以后GenBank公布的沙门菌基因序列，经进一步序列比对发现，SC1242基因还存在于1株肠炎沙门菌(S. Enteritidis)OLF-SE9-10012(GenBank No. CP009091，2014年公布)和1株纽波特沙门菌(S. Newport)CVM 21554 (GenBank No. CP009565，2015年公布)中，虽然在实验检测的肠炎沙门菌及纽波特沙门菌菌株中未发现阳性扩增，可能与菌株来源不同、非所有该两种血清型菌株都含有该基因有关，也可能是菌株检测数量较少导致检测结果的假阴性。为避免检测结果的假阳性，增加实验的准确性，建议在做rRT-PCR的同时增加O抗原血清凝集试验(仅需30 s)，因为猪霍乱沙门菌与肠炎沙门菌、纽波特沙门菌的O抗原均不同，且O抗原凝集试验简单，无需诱导。感染猪霍乱沙门菌不论败血型还是结肠炎型临床上均表现为高热，特别需要与其他以发热为主的主要病原进行鉴别诊断，本研究建立的rRT-PCR对国内临床常见的8种主要细菌性病原扩增均为阴性，因此可应用于发热病原的鉴别诊断。通过对模板进行稀释，发现模板浓度最低为50 fg/μl即可检出猪霍乱沙门菌，低于基于分子信标探针的RT-PCR可检测10 fg/μl的灵敏度^[10]，主要是由于两种检测方法的差异引起(基于探针的RT-PCR方法的敏感性高于终点法RT-PCR；且检测体系及检测引物、靶基因均不同)，但探针法的不足是其成本费用高于终点法，且分子信标的设计更严格、对靶序列有特殊的要求。

本研究中，rRT-PCR反应体系中所用的模板为提取的RNA，扩增结果阳性表明所检测的猪霍乱沙门菌处于活的增殖状态，更能反映样本潜在的感染性，排除死菌DNA干扰，应用于现场或临床时，更能体现样本中的活菌状态及疾病的急性感染期或活动期，避免假阳性结果(如环境及食品中残存猪霍乱沙门菌死菌DNA或污染该菌DNA)，减少当前血液分离培养猪霍乱沙门菌时间长、手工分离培养率偏低的影响，更适用于应急检测。而且本研究建立的rRT-PCR反应同样适用于粗提核酸，可以有效缩短菌株鉴定时间，配合简单易行的O抗原血清凝集试验，实现1 d内猪霍乱沙门菌与丙型副伤寒沙门菌及其他血清型沙门菌的鉴别诊断，有利于疾病的早期诊断、筛查及鉴别诊断。

本研究在实验室中建立了特异性好、灵敏度高的适用于猪霍乱沙门菌检测的单基因rRT-PCR方法，下一步将通过大量临床样品进一步验证、完善该技术。