2016, Vol. 31扩展功能
文章信息
- 周妍妍, 杨伟明, 李世荣, 闫东辉, 苏建荣
- ZHOU Yan-yan, YANG Wei-ming, LI Shi-rong, YAN Dong-hui, SU Jian-rong
- 临床分离非O1/O139群霍乱弧菌毒力及耐药特征分析
- Characteristics of virulence gen distribution and antibiotic resistance of non-O1/O139 Vibrio cholera
- 疾病监测, 2016, 31(6): 517-521
- Disease Surveillance, 2016, 31(6): 517-521
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.06.017
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文章历史
- 收稿日期：2016-01-19
2. 首都医科大学附属北京友谊医院感染科, 北京 100050
2. Infection Control Department, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是经水传播的革兰阴性致病菌，根据O抗原的不同，分为200多种血清群。产霍乱毒素(cholerae toxin,CT)的O1及O139血清群能引起霍乱暴发和流行，除O1和O139血清群以外的其他血清群霍乱弧菌统称为非O1/O139血清群霍乱弧菌或不凝弧菌(NAGs)。非O1/O139群霍乱弧菌广泛存在于环境中，尤其是水体和海产品中，能引起轻症胃肠炎、霍乱样腹泻、败血症或其他肠道外感染，但不引起霍乱暴发流行，其发病率通常远高于O1及O139血清群霍乱弧菌，近年来愈发引起关注[1-4]。
目前，非O1/O139 群霍乱弧菌血清群致病机制仍不明确，研究表明，非O1/O139 群霍乱弧菌通常不携带霍乱毒素基因ctxAB及毒素协同共调节菌毛基因tcpA，其主要毒力基因有hlyA(编码溶血素)、hapA(编码金属蛋白酶)、rtxA(编码RTX毒素)、nanH(编码唾液酸酶)、stn(编码热稳定肠毒素)、ompU(编码外膜蛋白)、zot(小带连结毒素)、ace(辅助霍乱肠毒素)、Ⅵ型分泌系统(T6SS)及Ⅲ型分泌系统(T3SS)相关基因簇，毒力基因的分布特征与其致病性密切相关[2, 5-8]。
国内外关于非O1/O139群霍乱弧菌的流行病学研究较少，美国马里兰地区非O1/O139 群霍乱弧菌感染率约占弧菌类的9%，我国非O1/O139群霍乱弧菌尚未纳入腹泻病原菌的常规监测，缺乏相关流行病学和病原学数据。非O1/O139群霍乱弧菌引起的轻微腹泻只需要口服补液治疗，但其引起的严重腹泻及败血症需用抗菌药物进行治疗[7]。氟喹诺酮类、三代头孢作为肠道传染病的一线抗菌药物在国内广泛应用，其耐药性也日趋严重，尤其是多重耐药菌株的出现，成为一个严重的公共卫生问题。本研究对20142015年北京友谊医院肠道门诊分离的非O1/O139群霍乱弧菌进行分析，以明确毒力基因的分布特征和耐药性特征，为非O1/O139群霍乱弧菌的监测和防治提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源2014和2015年410月从北京友谊医院肠道门诊腹泻患者分离。同时收集患者相关临床资料，包括性别、年龄、可疑食物及临床表现。
1.1.2 试剂蛋白胨水增菌液、庆大霉素分离培养基为北京陆桥技术有限公司产品，诊断血清由中国疾病预防控制中心提供，药敏试验用SENSITITRE药敏测试板为美国Thermo公司产品，聚合酶链反应(PCR)试剂为TIANGEN公司产品，PCR引物参照文献设计[2, 7, 9-10]，由生工生物(上海)股份有限公司合成。
1.1.3 仪器Vitek全自动细菌鉴定仪(Vitek，biosMerieumx)、PCR基因扩增仪(Bio-rad DNA Engine Dyad)和凝胶成像系统(Bio-Rad GEL Doc2000)。
1.2 方法 1.2.1 菌株鉴定临床粪便标本经蛋白胨水增菌后，经庆大霉素培养基分离培养，挑取动力阳性、氧化酶阳性的可疑菌落转种血平板，最后用全自动微生物生化鉴定系统鉴定，经血清学鉴定为非O1/O139群霍乱弧菌，所有菌株经分离纯化后储存于甘油肉汤中于-80℃保存。
1.2.2 药敏试验采用微量肉汤稀释法参照SENSITITRE药敏测试板操作说明进行药敏试验。药敏结果判断标准参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)标准中霍乱弧菌和肠杆菌[11]。质控菌株为大肠埃希菌ATCC®25922和金黄色葡萄球菌ATCC®29213。
1.2.3 毒力基因检测采用水煮法提取细菌基因组DNA。毒力基因的PCR扩增引物见表 1[2, 7, 9-10]。
| 毒力位点 | 基因 | 引物 | 序列(5′~3′) | 产物长度(bp) |
| CTXΦ | ctxA | ctxA-F | ACA GAG TGA GTA CTT TGA CC | |
| ctxA-R | ATA CCA TCC ATA TAT TTG GGA G | 308 | ||
| ctxB | ctxB-F | ATG CAC ATG GAA CAC CTC AAA ATA TTA CTG | ||
| ctxB-R | TCC TCA GGG TAT CCT TCA TCC TTT CAA TC | 231 | ||
| zot | zot-F | TCG CTT AAC GAT GGC GCG TTT T | ||
| zot-R | AAC CCC GTT TCA CTT CTA CCC A | 947 | ||
| ace | ace-F | TGA TGG CTT TAC GTG GCT TGT GAT C | ||
| ace-R | GCC TGT TGG ATA AGC GGA TAG ATG G | 134 | ||
| rstR | rstR1 F | AGC CAA CCA AAG AAA GGC AAT | 241(El Tor) | |
| rstR1 R | TCA TCT GTG GCC CAT CTT CC | |||
| rstR2 F | CTC ATC AGC AAA GCC TCC ATC | 186(Classical) | ||
| rstR2 R | TAG CAA ATG GTA TCG GCG TTG | |||
| rstR3 F | CCA GCA TTT CTG TTT CTT TG | 104(Calcutta) | ||
| rstR3 R | GGC AAC AAA GCA CAT TAA AG | |||
| VPI | tcpA | tcpA-F | CAC GAT AAG AAA ACC GGT CAA GAG | |
| tcpA-R1 | CGAAAGCACCTTCTTTCACGTTG | 481(El Tor) | ||
| tcpA-R2 | TTA CCA AAT GCA ACG CCG AAT G | 620(Classical) | ||
| tcA-F | ATG CAA TTA TTA AAA CAG CTT TTT AAG | |||
| tcA-R | TTA GCT GTT ACC AAA TGC AAC AG | 627(Atypical) | ||
| tcpI | tcpI-F | TAG CCT TAG TTC TCA GCA GGC A | ||
| tcpI-R | GGC AAT AGT GTC GAG CTC GTT A | 862 | ||
| tcpH/A | tcpH-F | AGC CGC CTA GAT AGT CTGT G | ||
| tcpA-R | TCG CCT CCA ATA ATC CGA C | 1289 | ||
| T3SS | vcsC | vcsC-F | GGA AAG ATC TAT GCG TCG ACG TTA CCG ATG CTA TGG G | 535 |
| vcsC-R | CAT ATG GAA TTC CCG GGA TCC ATG CTC TAG AAG TCG GTT GTT TCG GTA A | |||
| vcsV | vcsV-F | ATG CAG ATC TTT TGG CTC ACT TGA TGG | 742 | |
| vcsV-R | ATG CGT CGA CGC CAC ATC ATT GCT TGC | |||
| vcsN | vcsN-F | GGA TCC CGG GAA TTC CAT ATG CGT CGA CAG TTG AGC CAA TTC CAT T | 484 | |
| vcsN-R | CGG GGT ACC ATG CTC TAG ACG ACC AAA CGA GAT AAT | |||
| vspD | vspD-F | ATC GTC TAG AAC TCG AAG AGC AGA AAA AAG C | 422 | |
| vspD-R | ATC GGT CGA CCT TCC CGC TTT TGA TGA AAT | |||
| T6SS | vasA | vasA-F | GTA CGA CCG ATC CTG ACG TT | 342 |
| vasA-R | ATC TGA ATG GTC GTG GCT TC | |||
| vasK | vasK-F | GCG TCA AAT TCA GGA AGA GC | 399 | |
| vasK-R | CTG TCC CAG AAC CCA ACT GT | |||
| vasH | vasH-F | GTG GCA CGC TAT TTC TGG AT | 385 | |
| vasH-R | TTT CAG CTC ACG CAC ATT TC | |||
| 其他 | ompU | ompU-F | ACG CTG ACG GAA TCA ACC AAA G | 869 |
| ompU-R | GCG GAA GTT TGG CTT GAA GTA G | |||
| rtxA | rtxA-F | CTG AAT ATG AGT GGG TGA CTT ACG | 417 | |
| rtxA-R | GTG TAT TGT TCG ATA TCC GCT ACG | |||
| nanH | nanH-F | CTT CCT CCA ATA CGG TTC TTG TCT CTT ATG C | 314 | |
| nanH-R | TTC GGC TAC CAT CGG CAA CTT GTA TC | |||
| hlyA | hlyA-F1 | GGC AAA CAG CGA AAC AAA TAC C | 738/727(Classical) | |
| hlyA-F2 | GAG CCG GCA TTC ATC TGA AT | 481(El Tor) | ||
| hlyA-R | CTC AGC GGG CTA ATA CGG TTT A | |||
| stn/sto | stn-F | TCG CAT TTA GCC AAA CAG TAG AAA | 172 | |
| stn-R | GCT GGA TTG CAA CAT ATT TCG C | |||
| hapA | hapA-F | ACG TCC TCT GAA TTG GTT AG | 1782 | |
| hapA-R | CTG TAA CCG CGT AAC ATG AC | |||
| 注：rstR有3个等位基因型：埃尔托型(El Tor)、古典型(Classical)和加尔各答型(Calcutta)； tcpA有3个等位基因型：埃尔托型(El Tor)、古典型(Classical)和非典型(Atypical)；hlyA有2个等位基因型：埃尔托型(El Tor)和古典型(Classical)。 | ||||
2014和2015年410月在肠道门诊就诊腹泻患者共3800例，其中非O1/O139群霍乱弧菌阳性分离样品35例，分离率为0.9%，其中男性患者20例，女性患者15例，年龄范围14~83岁，发病时间集中在59月，8月为发病高峰，占40.0%。致病菌可疑来源多不明确，仅少部分明确来源于海产品(8.6%)、蔬菜水果(5.7%)或冷冻饮料(2.8%)。48.6%患者出现恶心，其中34.3%的患者有呕吐。57.1%的患者有腹痛，14.3%患者里急后重；28.6%的患者有发热(≥37.7 ℃)，20.0%的患者出现脱水。粪便通常为稀便或水样便，在高倍显微镜下有51.4%可见白细胞，20.0%可见红细胞。
2.2 药物敏感性分析35株非O1/O139群霍乱弧菌，对复方新诺明耐药率最高，达40.0%，其次为氯霉素(28.6%)、磺胺异恶唑(22.9%)、氨苄西林(17.1%)、萘啶酸(14.3%)和四环素(14.3%)。所有菌株对阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、头孢西丁、头孢吡肟及亚胺培南均100.0%敏感，对环丙沙星、强力美素、庆大霉素和阿奇霉素敏感性较高，均大于90%，具体结果见表 2。35株菌中单耐药菌9株(25.7%)，多重耐药菌11株(31.4%)，其中1株菌对5种抗生素(氨苄西林、氯霉素、复方新诺明、强力霉素、四环素)耐药，对3种抗生素(氯霉素、磺胺异恶唑、复方新诺明)耐药最为常见。
| 抗生素 | 折点(μg/ml) | 耐药(%) | 中度敏感(%) | 敏感(%) |
| 萘啶酸(1) | S≤16，R≥32 | 5(14.3) | 0(0) | 30(85.7) |
| 环丙沙星(2) | S≤1，I=4，R≥4 | 0(0) | 2(5.7) | 33(94.3) |
| 氨苄西林(2) | S≤8，I=16，R≥32 | 6(17.1) | 4(11.4) | 25(71.5) |
| 氯霉素(2) | S≤8，I=16，R≥32 | 10(28.6) | 3(8.6) | 22(62.9) |
| 磺胺异恶唑(2) | S≤256，R≥512 | 8(22.9) | - | 27(77.1) |
| 复方新诺明(2) | S≤2/38，R≥4/76 | 14(40.0) | - | 21(60.0) |
| 强力霉素(2) | S≤4，I=8，R≥16 | 2(5.7) | 0 | 33(94.3) |
| 庆大霉素(2) | S≤4，I=8，R≥16 | 0 | 2(5.7) | 33(94.3) |
| 阿奇霉素(1) | S≤2，I=4，R≥8 | 0 | 2(5.7) | 33(94.3) |
| 四环素(2) | S≤4，I=8，R≥16 | 5(14.3) | 4(11.4) | 26(74.3) |
| 阿莫西林/克拉维酸(2) | S≤8/4，I=16/8，R≥32/16 | 0(0) | 0(0) | 35(100.0) |
| 头孢曲松(2) | S≤1，I=2，R≥4 | 0(0) | 0(0) | 35(100.0) |
| 头孢西丁(2) | S≤8，I=16，R≥32 | 0(0) | 0(0) | 35(100.0) |
| 头孢吡肟(2) | S≤8，I=16，R≥32 | 0(0) | 0(0) | 35(100.0) |
| 亚胺培南(2) | S≤4，I=8，R≥16 | 0(0) | 0(0) | 35(100.0) |
| 注：(1)CLSI中肠杆菌药敏折点标准; (2) CLSI中弧菌属药敏折点标准。 | ||||
对35株非O1/O139群霍乱弧菌进行毒力基因分析，所有菌株均携带ompU和hlyA(其中埃尔托型hlyA携带率80.0%，古典型hlyA携带率为20.0%)，hapA (97.1%)、rtxA(91.4%)和T6SS中的vasA(97.1%)、vasK(97.1%)和vasH (94.3%)携带率较高，均大于90.0%，T3SS中的vcsC(82.9%)、vcsV(85.7%)、vcsN(80.0%)、vspD(80.0%)和唾液酸酶基因nanH(62.9%)阳性率也较高，而tcpI(17.1%)、古典型tcpA(5.7%)、zot(8.6%)阳性率较低。35株霍乱弧菌可以分为15种毒力基因型，结果如表 3所示，其中最主要的是毒力基因Ⅰ型(hlyA-rtxA-hapA-ompU-nanH-vasA-vasK-vasH-vcsC-vcsV-vcsN-vspD)，占40.0%；其次是毒力基因 Ⅱ 型占11.4%，比毒力基因 Ⅰ 型多了tcpI；毒力基因Ⅲ型占8.6%，比毒力基因 Ⅰ 型少了nanH。
| 毒力基因型 | 菌株数 |
| hlyA rtxA hapA ompU nanH vasA vasK vasH vcsC vcsV vcsN vspD | 14 |
| tcpI hlyA rtxA hapA ompU nanH vasA vasK vasH vcsC vcsV vcsN vspD | 4 |
| hlyA rtxA hapA ompU vasA vasK vasH vcsC vcsV vcsN vspD | 3 |
| hlyA rtxA hapA ompU nanH vasA vasK vcsC vcsV vcsN vspD | 2 |
| tcpA hlyA rtxA hapA ompU vasA vasK vasH vcsC vcsV vcsN vspD | 2 |
| hlyA rtxA hapA ompU nanH vasA vasK vasH vcsC | 1 |
| hlyA rtxA hapA ompU vasA vasK vasH vcsC | 1 |
| hlyA rtxA hapA ompU vasA vasK vasH vcsV | 1 |
| hlyA ompU vasH vcsC vcsV vcsN vspD | 1 |
| hlyA hapA ompU vasA vasK vasH vcsV | 1 |
| hlyA rtxA hapA ompU vasA vasK vasH | 1 |
| tcpI hlyA rtxA hapA ompU nanH vasA vasK vasH vcsV vcsN vspD | 1 |
| tcpI zot hlyA hapA ompU vasA vasK vasH | 1 |
| zot hlyA rtxA hapA ompU nanH vasA vasK vasH vcsV vcsN vspD | 1 |
| zot hlyA rtxA hapA ompU vasA vasK vasH vcsC | 1 |
非O1/O139群霍乱弧菌引起的腹泻在世界各地时有发生，但由于其不引起霍乱暴发流行，易致人们忽略其危害的严重性。本研究中的非O1/ O139群霍乱弧菌临床症状多样化，感染来源不一，需引起人们的关注。
有研究报道20022010年在印度加尔各答腹泻病例中分离的281株非O1/O139群霍乱弧菌，氯霉素耐药率达到80.4%，氨苄西林、萘啶酸、四环素耐药率分别为55.5%、57.6%和80.0%[4]。20112013期间广东分离的24株非O1/O139群霍乱弧菌，复方新诺明、萘啶酸、四环素的耐药率分别为70.8%、 37.5%、20.8%[12]。与临床分离菌株相比，美国马里兰州水体分离的非O1/O139群霍乱弧菌对氯霉素、环丙沙星全部敏感，对萘啶酸、复方新诺明、四环素敏感率分别为98.4%、99.7%和99.3%，而对氨苄西林耐药率仅为6.8%[7]。本研究中35株非O1/O139群霍乱弧菌对磺胺类、氯霉素、氨苄西林、一代喹诺酮类和四环素的耐药率低于印度和广东分离的菌株，高于美国分离的环境株；而对临床常用的二代喹诺酮类、β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合物、三四代头孢和亚胺培南敏感；但有2株菌对环丙沙星中度敏感，提示临床需注意合理用药，避免耐药株特别是多重耐药株的产生。
CTX是霍乱弧菌主要的毒力相关元件，本研究主要检测了其中的ctxA、ctxB、zot和ace。结果未检测到ctxA、ctxB和ace的存在，但其中3株菌含有zot，并有1株菌携带了加尔各答型rstR。这种zot存在而ctxAB缺失的情况在其他文献中也有报道[10]，而rstR阳性提示携带了pre-CTX噬菌体[13]。VPI(V. cholerae pathogenicity island)是一个大小为39.5 kb的毒力基因岛[10]，本研究主要检测了其中的毒力调节基因tcpH/A，毒素协同调节菌毛基因tcpA及其负调节基因tcpI，其中tcpA和tcpI携带率不高，未发现tcpH/A基因。从德国和奥地利病例分离的18株非O1/O139群霍乱弧菌，一半菌株携带了ompU[2]，而本研究中ompU携带率达到了100.0%，不过外膜蛋白OmpU是否作为肠道潜在的定植因子，仍然存在争议[14]。hlyA编码的溶血素和hapA编码的蛋白酶能够使细胞产生空泡，并能够影响上皮细胞的紧密性，两者与产细胞毒素的rtxA一起，能导致细胞的分离和变圆[15-17]，本研究菌株基本携带了这3种毒力基因。Ⅵ型分泌系统T6SS参与细菌的毒力和适应性，给予霍乱弧菌在肠道内和环境中相对于其他细菌的竞争优势[5]，Ⅲ型分泌系统存在于许多致病的革兰阴性杆菌中，通过运输毒力效应蛋白进入宿主细胞从而直接影响宿主机能，非O1/O139群霍乱弧菌T3SS介导的毒力在幼兔模型中得到证实，其能使霍乱弧菌定植到肠道并引起病理学变化和腹泻[6]。本研究中大部分非O1/O139群霍乱弧菌携带T6SS和T3SS，而其他研究显示O1群和O139群霍乱弧菌基本不携带T3SS分泌系统[3]。在本研究中，菌株的唾液酸酶nanH携带率为62.9%，高于美国沿海地区环境株19.7%的携带率[7]；热稳定肠毒素stn和sto未检出，而在美国沿海地区环境株中stn/sto的携带率为21.8%[7]。在北京地区分离的35株非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因型别多样，其中主要携带了溶血素、重复毒素、蛋白酶、外膜蛋白、唾液酸酶、T6SS和T3SS多种毒力相关因子，提示这些毒力相关因子与其临床致病性密切相关。
本研究对20142015年北京友谊医院肠道门诊分离的非O1/O139群霍乱弧菌进行了毒力和药敏表型特征分析，初步呈现了北京地区非O1/O139群霍乱弧菌的病原学特征：北京地区非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因型别多样化，对多种抗菌药物耐药率较高，可能成为危害公众卫生安全的潜在威胁，预防及控制非O1/O139群霍乱弧菌提供了数据支持。
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