手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的急性传染病，重症病例多由肠道病毒71型(EV71)感染所致，多合并脑炎等神经系统并发症，部分病例留有后遗症^[1]，甚至危及生命。寻找一种快速判断病情严重程度、指导评估预后的检测指标，对降低重症病例病死率和致残率有重要意义。神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、S-100β 和髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)是目前公认的评估神经胶质细胞、神经元损伤的生物学标志物^[2-4]。本研究通过观察EV71脑炎患儿血清和脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中NSE、S-100β 及MBP的变化，以期能较早地反映EV71感染后中枢神经系统(CNS)神经细胞受损状况和严重程度及与预后的关系。

所有病例来自于2012年3月至2013年10月在杭州市儿童医院住院的手足口病患儿，共70例，且病原学检测结果确定为EV71感染。确诊EV71感染的病原学检测方法(至少有一项检测结果为阳性)：①采集肛拭子或咽拭子标本经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测结果为EV71核酸阳性；②急性期血清或CSF标本经ELISA法检测结果为EV71 IgM抗体阳性。确诊EV71感染的病原学检测由杭州市儿童医院检验科人员完成。选择杭州市儿童医院儿外科同期住院的非神经系统疾病手术患儿作为对照组。

依据原卫生部《肠道病毒71型(EV71)感染重症病例临床救治专家共识》^[5]的诊断标准：临床诊断病例具有下列之一者即可确诊。(1)肠道病毒[柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)、EV71等]特异性核酸检测阳性。(2)分离出肠道病毒，并鉴定为Cox A16、EV71或其他可引起手足口病的肠道病毒。(3)急性期与恢复期血清Cox A16、EV716或其他可引起手足口病的肠道病毒中和抗体有4倍以上的升高。临床分类：(1)普通病例：手、足、口、臀部皮疹，伴或不伴发热。(2)重症病例：①重型：出现神经系统受累表现。如：精神差、嗜睡、易惊、谵妄；头痛、呕吐；肢体抖动，肌阵挛、眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍；无力或急性弛缓性麻痹；惊厥。体征可见脑膜刺激征，腱反射减弱或消失。②危重型：出现下列情况之一者，a.频繁抽搐、昏迷、脑疝；b.呼吸困难、紫绀、血性泡沫痰、肺部啰音等；c.休克等循环功能不全表现。将患儿分为普通病例组、重症病例组(再分为重症重型组和重症危重型组)。并设立对照组。

研究与对照病例选择及分组：(1)普通病例组：24例。男性13例，女性11例；年龄7月龄至4岁9月龄，平均年龄(1.93±1.08)岁；平均病程8 d(7～10 d)；其中8例患儿有惊跳，2例患儿有肢体抖动，3例患儿有惊厥，3例患儿有呕吐。选择入院时疑为手足口病并发中枢神经系统损害，经CSF常规、生化检查无异常，脑电图以及影像学检查正常，排除中枢神经系统损害的手足口病普通病例。(2)重症病例组：46例。男性30例，女性16例；年龄10月龄至11岁7月龄，平均(2.84±1.74)岁。平均病程12 d(6～15 d)。其中重症重型组31例，男21例，女10例，平均(3.0±2.0)岁；31例中18例患儿有惊跳，16例患儿有肢体抖动，1例患儿有嗜睡，1例患儿有惊厥，16例患儿有呕吐。重症危重型组15例，男性9例，女性6例，平均(2.5±1.1)岁；其中11例患儿有惊跳，12例患儿有肢体抖动，8例患儿有昏迷，7例有嗜睡，6例患儿有频繁惊厥，9例有呼吸困难、紫绀、肺部啰音，5例有休克等循环功能不全表现。(3)对照组：21例。男性11例，女性10例；年龄12月龄至4岁10月龄，平均(2.29±0.91)岁。各组患儿在入院时性别、年龄、病程对比，差异无统计学意义。

各组病例于入院24 h内抽取静脉血3～4 ml和CSF 2 ml(对照组于手术当日行腰麻时抽取CSF)，CSF标本另送检常规，生化及细菌培养(对照组只做CSF常规和生化)。重症病例组患儿于10～14 d进行第2次静脉血和CSF采集，每一相对应的静脉血和CSF标本的采集时间相差不超过1 d；静脉血低温离心取上清液，血清及CSF存于-70 ℃冰箱中待检。剔除溶血标本。采用双抗体夹心ELISA法检测血清及CSF中S-100β及MBP的含量。S-100β及MBP检测试剂均购自上海信然生物技术有限公司(S-100β 批号 85064709；MBP批号 83403011)。NSE 采用电化学发光法，试剂盒购自罗氏诊断有限公司(批号17462203)。EV71型IgM检测方法为捕获酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法，实验步骤及计算按照试剂说明由专人负责统一检测完成。

根据检验是否符合正态分布，采用Lenvene's方差齐性检验，对于正态分布数据采用均数±标准差(x±s)进行描述统计。计量资料组间比较采用单因素方差分析(One-way analysis of variance,ANOVA)，均数多重比较，方差齐性采时采用LSD法(Least-significant difference)，方差不齐者采用Dunnett't T3法；正态双变量相关分析采用Pearson积矩相关系数法。P<0.05为差异有统计学意义。

不同组间血清和CSF中MBP、NSE和S-100β的含量比较见表 1。结果显示重症危重型组、重症重型组血清和CSF中NSE和S-100β水平均显著高于普通病例组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，重症危重型组CSF中NSE和S-100β水平也高于重症重型组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；普通病例组血清和CSF中NSE和S-100β水平与对照组比较差异无统计学意义(均 P>0.05)；各组血清和CSF中MBP水平差异无统计学意义(P>0.05)。

表 2显示，重症病例组急性期血清和CSF中NSE、S-100β含量均显著高于恢复期和对照组，差异有统计学意义(均P<0.01)，但恢复期血清和CSF中NSE、S-100β含量与对照组差异无统计学意义(均P>0.05)；重症病例组急性期CSF中MBP含量与恢复期和对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)，重症病例组恢复期血清和CSF中MBP含量与对照组比较差异亦无统计学意义(P>0.05)。

重症病例组血清与CSF中NSE、S-100β和MBP的含量均呈正相关(r分别为0.886、0.875，均P<0.01)。

近年来，对脑组织损伤后神经化学标志物的研究正在逐步深入，这些标志物主要为NSE、S-100β和MBP等。NSE是糖酵解途径的关键酶，特异性定位在神经元内；S-100β蛋白是一类分子质量较小，具有广泛性的生物学活性的EF手型钙结合蛋白，主要定位于中枢神经系统的星形细胞和少突神经胶质细胞，因而被认为是神经胶质的标记蛋白；MBP是中枢神经髓鞘膜的主要成分。文献报道，测定血液和CSF中上述各项生化指标水平的变化，可反映神经元、胶质细胞、神经髓鞘膜结构损伤严重程度的状况^[6-7]。

据报道HFMD重症病例主要为EV71感染，91%年龄在5岁以下，70%可并发脑炎^[8]。现在认为，EV71 主要以逆轴浆运输的形式通过周围神经轴突侵入中枢神经，然后直接侵害中枢神经引起CNS 炎症及脑实质细胞的一系列损害。尸检结果证实，EV71重症感染患儿中枢神经系统严重受损，主要累及脑干。EV71脑炎与其他病毒性脑炎的病理变化相似，病变早期主要以脑血管周围为主，以后可出现局部或广泛的神经细胞坏死及胶质细胞增生等^[9]。近年不少文献报道病毒性脑炎患者CSF及血中NSE、S-100β和MBP水平明显升高，其升高程度与病情严重程度密切相关，但有关EV71脑炎的研究尚不多见^[10]。本实验结果显示，重症危重型组、重症重型组血清和CSF中NSE和S-100β水平均显著高于普通病例组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；表明EV71脑炎患儿的病理过程有神经元和胶质细胞的损害。重症危重型组血清和CSF中NSE和S-100β水平均高于重症重型组，与文献报道相符^[11]，说明EV71脑炎病情越重，NSE、S-100β的含量越高。本研究结果说明血清和CSF中NSE、S-100β的含量与脑损伤程度有关，因此认为血清和CSF中NSE、S-100β的含量可作为EV71脑炎患者脑损伤的重要生化指标之一。但各组血清和CSF中MBP水平无显著差异，提示EV71脑炎患者神经胶质细胞及髓鞘损伤可能不明显；也可能是MBP水平变化一般在脑神经损害后72 h才有轻度升高^[4]，而本组多数病例于出现症状后1~3 d内抽血和CSF，此时MBP升高可能尚不明显。

本研究动态检测初步表明，CSF和血清NSE、S-100β含量的变化与EV71脑炎患儿病情轻重相关。进入病情恢复期，两项指标随病情好转均明显下降；11例患儿病情加重或头颅MRI显示多发病灶，两项指标明显升高，说明NSE、S-100β含量可反映脑损害的程度，可作为预报病情变化的指标。这将有助于临床监测EV71脑炎患儿病情变化和评估治疗的策略及效果。

CSF是神经元代谢的重要场所，研究结果显示，CSF中的NSE、S-100β的水平高于血清，提示CSF中的NSE、S-100β的水平更能反映神经元的损害情况。但由于危重EV71脑炎患儿采集CSF较为困难，本研究结果也显示，重症病例组血清与CSF中的NSE、S-100β 含量呈显著性正相关。故提示检测血清中NSE和S-100β 含量可反映其CSF水平，有助于预测脑损伤。