人腺病毒(human adenoviruses,HAdV)属于腺病毒科的哺乳动物腺病毒属，目前文献报道和GenBank数据库资料显示HAdV已有67个型别，其中52个血清型可分为A、B、C、D、E、F、G 7个亚属^[1]，与呼吸道感染相关的多集中于 B 亚属(HAdV3、HAdV7、HAdV14 和HAdV21)、C 亚属(HAdV1、HAdV2 和HAdV5)和 E 亚属(HAdV4)^[1-3]。与胃肠道感染有关的是A、F和G亚属，与眼部、肾脏及尿道感染有关的是D和E亚属^[4]。近年来新发现的HAdV53~67是通过全基因组测序和基因进化分析确定的，由同亚属的某两个或几个血清型同源重组而成^[5],如HAdV55是由HAdV11和HAdV14的基因重组形成的。HAdV感染在我国比较常见，其中腺病毒肺炎是我国发病率最高的病毒性肺炎之一，在特殊情况下(如环境密闭、劳累、免疫力低下等)传染性较强，可以引起人类许多疾病，包括流感样疾病、急性咽炎、结膜炎、婴幼儿致死肺炎等严重疾病。现对 2014 年 12 月至2015年2月期间甘肃省陇南市康县儿童中HAdV7引起的呼吸道感染疫情进行流行病学及病原学分析，结果报告如下。

采用统一的流行病学个案调查表，病例定义为“2014 年12月20日至 2015年2月2日在陇南市康县儿童中出现反复发热(体温≥38 ℃)、咳嗽、咳痰等呼吸道感染症状的患者”，选取该时间段在康县人民医院、城区儿科诊所和陇南市人民医院就诊及住院的儿童中符合病例定义的病例进行流行病学个案调查和咽拭子采集。

康县人民医院门诊和儿科住院部、城区1所个体诊所和陇南市人民医院共采集发热患儿咽拭子118份，冷藏保存送甘肃省疾病预防控制中心(CDC)进行检测。

流感病毒核酸检测使用的引物和探针为中国CDC病毒病预防控制所提供，实时荧光定量(real-time)聚合酶链反应(PCR)试剂盒为德国Qiagen公司生产(QuantiTect Probe RT-PCR Kit)。HAdV和呼吸道合胞病毒(RSV)A/B核酸检测试剂盒，均购自江苏硕世生物科技股份有限公司。病毒RNA/DNA核酸提取试剂盒为德国Qiagen公司产(QIAampMinElute Virus Kit)，腺病毒Hexon基因扩增引物(Ad1：5′-TTC CCC ATG GCI CAY AAC AC-3′和 Ad2：5′-CCC TGG TAK CCR ATR TTG TA-3′) (序列由中国CDC病毒病预防控制所提供)由上海生物工程有限公司合成，PCR产物大小 482 bp。多重RT-PCR 试剂盒(呼吸道病毒检测试剂盒RV15)由杭州纽罗西敏生物科技有限公司提供。

Applied Biosystems 7500 real-time PCR仪和2720普通PCR仪，Bio-Rad的凝胶成像仪(RaDx)等。

按照德国Qiagen公司病毒RNA/DNA核酸病毒提取试剂盒操作说明，提取咽拭子样本核酸后，采用上述 3 种real-time PCR试剂盒进行检测。

选取HAdV核酸测定试剂盒检测阳性的样本核酸，使用引物 Ad1和Ad2进行PCR反应，反应条件: 94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min。反应体系: 10×buffer 5 μl，dNTP (2.5 mmol/L) 4 μl，TaKaRa ExTaq (5 U/ μl) 0.25 μl，上下游引物 Ad1(10 μmol/L)和下游引物 Ad2 (10 μmol/L)各2 μl，加水补足至50 μl。PCR产物经加有GelRed染料的 1.5%琼脂糖凝胶电泳后确定有482 bp的目标条带，再将PCR产物送往宝生物工程(大连)有限公司进行测序。利用ClustalⅩ软件对测序结果进行核苷酸序列同源性分析。从GenBank中选取与阳性序列相似的参考毒株，用 Mega 6.0软件构建进化树。

采用人喉上皮癌细胞(Hep-2)对腺病毒核酸阳性咽拭子标本进行病毒分离 ,将标本接种于细胞瓶中，每日观察细胞，如有细胞病变 (cytopathic effect，CPE)出现 ,待 CPE 达到 75% 以上时收获，置-70 ℃冰箱冻存以备二次传代。如果7 d后没有CPE出现，那么再盲传1代继续观察7 d 。连续传代 3 次后认为阴性者则判定该标本病毒分离结果为阴性。

2015年1月7日甘肃省CDC接到陕西省CDC通报，2015年1月47日在汉中及西安市等住院就诊的肺炎患儿中有29例户籍为甘肃省康县，其中2例症状较重。实验室检测发现其中5例为HAdV感染。甘肃省CDC组织相关机构对康县县医院、部分卫生院和城区2所个体诊所的调查显示，2014年冬季与往年比较气候干燥，症状以发热、咳嗽为主的呼吸道疾病较往年增高20%~30%，而且患者症状重，病程长，二次感染的比例高，部分患儿在退热后出现腹泻症状。康县县医院、县城1家个体诊所等3家医疗单位共搜索出符合本次病例定义的住院患儿118例，未发现死亡病例。

118例患者年龄0~11岁，5岁以下儿童占发病数的88.14%(104例)，最小的52 d，最大的11岁，见表 1。其中男性67人，女性51人，男女性别比为1.31∶1。

自2014年12月下旬起，儿童中上呼吸道感染病例不断增多，至12月底达到发病高峰，每天门诊量是往年同期的2倍，2015年1月中旬开始回落，并持续到2015年1月底。期间有一定比例的患病儿童表现为支气管肺炎和病毒性肺炎。截至2月2日，符合病例定义的病例118例。发病时间分布见图 1。

图 1 2014年12月20日至2015年2月2日呼吸道感染病例分布 Figure 1 Distribution of respiratory infection cases in Gansu, 20 December 2014 to 2 February 2015

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病例在各乡镇均有分布。从采集标本的118例病例分析可见，33例腺病毒阳性病例主要分布在城关镇、岸门口镇、望关镇、白杨乡、店子乡等13个乡镇，占全县21个乡镇的61.9%。见表 2。

患儿起病急，临床表现为发热占100%(最高达42 ℃)、发热持续时间长(3~13 d)，咳嗽、咳痰、气喘等症状，肺部影像学检查呈支气管肺炎者占65%，10例为肺炎表现，有11例患儿在病程后期出现腹泻症状，有8例患儿出现二次感染。重症患儿较少，病程较长。

共检测118份患者咽拭子，HAdV、流感病毒[FluA(H3N2)]、呼吸道合胞病毒(RSV)3种病原任一阳性的46例，阳性率38.98%，其中HAdV阳性33份，阳性率27.96%，FluA(H3N2)7例，阳性率5.93%，RSV阳性6例，阳性率5.08%，HAdV和RSV同时阳性2例，阳性率1.69%；对HAdV阳性标本Hexon基因进行扩增，成功扩增到29份产物送检测序，鉴定为HAdV7。见表 3、表 4及图 2。

图 2 2015年甘肃省康县儿童HAdV阳性标本与HAdV B亚属代表株基于hexon基因序列全长构建的基因亲缘性关系树(9份标本与甘肃省20132014年分离的HAdV-7毒株同源性为100%) Figure 2 Phylogenetic tree of adenovirus isolated in Gansu in 2015 and adenovirus Bsubgenus representative strains based on hexon gene sequence length (9 specimens of HAdV7 shared 100% homology with the strains isolated in Gansu during 2014-2015)

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从表 4可见，个体门诊病例中HAdV阳性率12.50%(4/32)，在县级及陇南市人民医院康县患儿标本中HAdV检出率33.72%(29/86)，县级以上医疗机构病例中HAdV阳性率显著高于个体门诊病例(χ²=5.23，P<0.05)。1月10日前54份标本中，HAdV阳性率16.67%，FluA(H3N2)阳性率12.96%，RSV阳性率1.85%；1月27日采集标本21份中HAdV阳性率42.86%，FluA(H3N2)未检出，RSV阳性率33.33%；1月29日采集标本43份中HAdV阳性率34.88%，提示HAdV在康县儿童中持续存在感染病例，1月上旬同时存在FluA(H3N2)和HAdV的流行，1月中旬开始同时存在RSV和HAdV的流行。

33份HAdV阳性标本用Hep-2细胞进行分离培养，盲传3代后，分离、鉴定共获得病毒18株，送中国CDC病毒病预防控制所进行复核鉴定及hexon基因片段序列测定，结果有17株病毒是HAdV7,1株为HAdV3，hexon基因片段分析17株HAdV7病毒位于同一分支上，同源性达100%，与陕西省2012年分离病毒HAdV7的同源性达100%。1株HAdV3的病毒与甘肃省在20132014年呼吸道症候群标本中分离病毒的同源性达100%。详见图 2~4。

图 3 2015年甘肃省HAdV分离株与HAdV A~G亚属代表株基于hexon基因序列全长构建的基因亲缘性关系树(17株HAdV7的同源性为100%) Figure 3 Phylogenetic tree of adenovirus isolated in Gansu in 2015 and adenovirus A-G subgenus representative strains based on hexon gene sequence length (17 strains of HAdV7 shared 100% homology)

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图 4 2015年甘肃省HAdV3和HAdV7分离株与其他国家和地区流行株基于hexon基因序列全长构建的基因亲缘性关系树 Figure 4 Phylogenetic tree of HAdV3 and HAdV7 isolated in Gansu in 2015 and circulating strains in other countries based on hexon gene sequence length

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HAdV感染多在冬、春季发生,主要经呼吸道传播。临床表现包括急性咽痛、发热，体温可达39 ℃,常有咳嗽,可有区域性淋巴结肿大。体检可见咽部充血、扁桃体肿大，多无分泌物，发生肺炎时有相应体征^[5]。HAdV感染的易感人群多为婴幼儿，儿童呼吸道HAdV感染病情轻重不一，轻者仅表现为上呼吸道感染，重者可致小儿肺炎，并可累及全身各系统，重症HAdV肺炎病死率高^[6-8]。结合临床表现、流行病学及实验室检测结果判定，陇南市康县2014年12月20日至2015年2月2日期间在部分乡镇儿童中发生的以HAdV7感染为主的呼吸道感染，前期与当地FluA(H3N2)流行高峰重叠，后期与儿童中RSV流行形成叠加；表现为呼吸道感染病例较往年显著增加，流行持续时间长，并有一定比例的肺炎病例。依据有:(1)患病儿童HAdV阳性标本及分离到的HAdV hexon基因核苷酸序列同源性达 100%,与我省近3年分离到的HAdV7属于同一个病毒的传播链；(2)33例阳性病例分布在全县的21个乡镇中的13个乡镇，期间不同时间标本中HAdV持续存在；(3)此段时期也是甘肃省FluA(H3N2)和RSV流行的高峰。

HAdV的主要传染源为患者和隐性感染者，病毒潜伏期为 3~8 d，潜伏期末至发病急性期传染性最强。各年龄段人群均可感染HAdV，但婴幼儿、老年人以及免疫力低下者较为易感。HAdV主要通过呼吸道、粪口途径和接触污染物传播^[1]。图 2~4分析结果显示，HAdV3、HAdV7是甘肃省常见的呼吸道感染病原，此次疫情分离的HAdV7未发现变异，由于2014年冬季陇南市康县与往年相比，气候干燥，连续40余天未降雪，气温偏低，易于呼吸道疾病的传播，所在县医院儿科病房及门诊输液大厅通风一般，病床拥挤，门诊诊室病例拥挤，院内感染传播可能是加速疫情扩散的原因之一。

近年来国内外曾发生多起由HAdV引起的呼吸道感染暴发疫情，如近年美国也报道了新兵训练营多起由HAdV B 亚型、HAdV14等感染引起的暴发疫情^[9-11]；新加坡报道由HAdV11引起的发热呼吸道感染疾病暴发疫情^[12]，古巴报道1起由HAdV5感染引起的暴发疫情^[13]；国内，2015年来在辽宁地区报道HAdV56引起的眼结膜炎疫情，2004年以来在江苏、广东、陕西等多省发生由HAdV3感染引起的暴发疫情^[14-16]；2011年甘肃省通渭县一中学暴发一起由HAdV14引起的上呼吸道感染疫情^[17],陕西、江西、山西、河南等多地儿童中暴发HAdV7引起的肺炎疫情^[18-21]。甘肃省近年来对5岁以下住院儿童呼吸道感染病例中HAdV检测的阳性率为8.18%(32/391)，在SARI病例中HAdV的检出率为2.98%(24/804)，分离到的呼吸道HAdV主要为HAdV7、HAdV3 HAdV1和HAdV14及HAdV2，提示HAdV是引起呼吸道疾病的主要病原之一，疾病负担较重，因HAdV感染的疾病临床表现多样，特异性差，只能通过实验室检测才来确认，建议开展HAdV哨点监测以全面掌握HAdV引起疾病的流行规律及疾病负担等。