致泻大肠埃希菌(diarrheagenic Escherichia coli，DEC)，是指能够引起肠道内感染，包括胃肠炎、腹泻等临床症状的大肠埃希菌，是现今引起全球感染性腹泻流行和地方腹泻暴发的主要病原体。以携带致病基因的不同可分为6类：致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)、产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)、侵袭性大肠埃希菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)、出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic E.coli，EHEC)、黏附性大肠埃希菌(enteroadherent E.coli，EAEC)及弥散黏附性大肠埃希菌(diffusely adherent E.coli，DAEC)^[1-2]。产毒性大肠埃希菌是常见的一种致泻大肠埃希菌，可产生不耐热肠毒素(heat labile enterotoxin,LT)和耐热肠毒素(heat stable enterotoxins，STs)，STs又分为STp 和 STh^[3]。它是发展中国家儿童和旅游者腹泻的主要原因，每年约导致全球2亿人次腹泻，38万人死亡^[4]。目前国内大多数地区，散发腹泻病例中，ETEC的检出率仅次于肠致病性大肠埃希菌，并且具有上升的趋势^[5-7]。因此，本研究通过对散发感染性腹泻人群分离的ETEC进行脉冲场凝胶电泳分型(pulsed-field gel electroporesis，PFGE)及相关流行病学分析，旨在了解深圳市龙岗区腹泻患者ETEC感染的流行特征及菌株间基因型差异和联系，为人群感染的防控及ETEC分子分型的数据库提供依据和基础数据。

收集深圳市龙岗区2家综合性的感染性腹泻哨点医院(区中心医院和人民医院)肠道门诊中急性感染性腹泻患者的粪便标本。病例纳入标准为每日排便超过3次，且粪便性状异常(稀便、水样便、黏液便、脓血便等)。20102015年共收集1204人份标本。

从深圳市感染性腹泻监测网上获得宿主相关流行病学信息，包括患者年龄、性别、户籍类型、居住地址和发病时间等内容。

LB琼脂(杭州微生物试剂厂)，51种大肠埃希菌O型诊断血清(日本生研株式会社生产)，TaKaRa Taq^TM试剂盒宝生物工程大连有限公司，蛋白酶K(德国Merck公司)，限制性内切酶XbaⅠ(美国New England公司)，Seakem Gold琼脂糖(美国Cambrex Bio Science Rockland公司)，细胞悬浮缓冲液CSB，细胞裂解缓冲液CLB，TE缓冲液。

仪器设备：PCR扩增仪器(美国Bio-Rad公司)，浊度仪(Densimat bioMerieux France)，PFGE 脉冲场凝胶电泳仪及配套设备(CHEF Mapper，美国Bio-Rad公司)，凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)及BioNumerics 5.1分析软件(比利时Applied Maths公司)。

按感染性腹泻诊断标准WS 271－2007进行。

DNA模板的制备(沸水浴法) 取LB琼脂平板上分离纯培养的菌落置于装有100 μl无菌蒸馏水的1.5 ml离心管中，振荡混匀后100 ℃水浴10 min，12 000 r/min离心2 min，吸取上清液即为DNA模板，-20 ℃保存备用。

PCR检测 采用可同时检测EPEC、ETEC、EAEC、EHEC、EIEC 五种致泻大肠埃希菌多重PCR方法进行目的基因的扩增，ETEC对应的目的基因为estIa、estIb、elt。反应总体积为50 μl，在1.5 ml的离心管中依次加入10×buffer 10 μl，dNTP 8 μl，引物rrs-F/R (10 μmol/L)各0.1 μl，ipaH-F/R(10 μmol/L)各0.2 μl，lt-F/R(10 μmol/L)各0.4 μl，aggR-F/R(10 μmol/L)各0.6 μl，eaeA-F/R(10 μmol/L)各0.5 μl，stx1-F/R(10 μmol/L)各0.5 μl，stx2-F/R(10 μmol/L)各0.5 μl，stIb-F/R (10 μmol/L)各 2 μl，stIa-F(10 μmol/L)2 μl，Taq酶0.8 μl/5 U，DNA模板2 μl补充无菌水至50 μl。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min^[8]。

参照“PulseNet international”网络实验室推荐的非O157大肠埃希菌PFGE分型标准方法进行操作^[9]，使用全球参考菌株布伦登卢普沙门菌H9812作为分子质量Marker和质控菌。选用50 U Xba Ⅰ进行酶切，电泳时间18 h，脉冲时间 2.16~54.17 s。用BioNumerics 软件对基因图谱进行聚类分析，产生的条带以PN表示，P代表PFGE型，N代表图 1中带型的位置，同一PFGE分型代表DNA片段数目和大小一致的电泳图谱。

统计学分析 病例相关数据导入Excel软件后，运用SPSS 20.0软件进行统计分析。对病例基本情况进行简单的统计描述，用χ²检验比较分析ETEC检出率在人群和时间分布上的情况，用Fisher确切概率法比较分析毒力基因在性别、年龄分布上的情况。

聚类图谱 根据非加权配对算术平均法(UPGMA)构建，最优化值0.5%，条带位置差异容许度1.0%。相似系数采用Dice方法计算。

从1204份标本中检出70株ETEC，阳性率为5.8%。其中38株分离自男性，32株分离自女性，男女性别比为1.19∶1。感染者年龄中值为27岁，最大年龄为82岁，最小1月龄，病例集中在19~35岁的成年人中，占60.0%(42/70)，检出率在年龄分布上差异有统计学意义(P<0.05)，在性别、户籍分布上差异无统计学意义(P>0.05)，见表 1。

20102015年各年间ETEC检出率差异无统计学意义(P>0.05)。感染病例集中在79月，占样本总数的51.4%(36/70)，检出率在季节分布上差异无统计学意义(P>0.05)，见表 2。

ETEC携带的毒力基因以estIb多见，占65.7%(46/70)，其次为estIa，占21.4%(15/70)；而elt仅占10.0%(7/70)。检出2株同时携带estIb和elt基因型菌株，比重为2.9%(2/70)，血清型均为O6。比较性别、年龄中ETEC的毒力基因分布情况差异无统计学意义(P>0.05)，不同性别、年龄其毒力基因分布差异无统计学意义，见表 3。

70株ETEC中除4株血清凝集试验阴性外，其余分属于14种血清型，分别是O1、O6、O8、O15、O25、O27、028、028a、O111、O128、O148、O153、O159、O169，优势血清型是O159、O148、O25、O6，分别占25.7%(18/70)、18.6%(13/70)、11.4%(8/70)、7.1%(5/70)。

ETEC产生的DNA片段条带数目在14~26之间，相似度在43.9%~100.0%之间。70株ETEC共分为60个PFGE型(P1~P60)。有8个带型包含2~3株不等的菌株，见表 4，其余的带型均只含1株。这些带型中除了P12，其余带型内包含的菌株血清型相同，且分属于O148、0159、O25血清型。同带型的菌株毒力基因都相同，并以estIb为主(87.5%，7/8)。值得关注的是，P20和P22带型对应的2个病例发病时间只相差2 d，且病例均分布在龙城街道，但饮食史不详，不能判断是否存在共同暴露；P25、P29带型对应菌株检出时间相差3年，检出时间跨度较大(表 4)。

共有10组(A~J)群组组内包含的菌株基因图谱相似度>90.0%，见图 1。各群组所含的菌株数量不一，其中C组含11株，G组含10株，其他群组含有2~3株。C克隆株间的相似度为90.8%，菌株分属于O148和O25两种血清型，前者比重为81.8%(9/11)；G克隆株间的相似度为90.5%，菌株均属于O159血清型。

图 1 70株ETEC菌株的聚类分析 Figure 1 Clustering analysis on 70 ETEC strains

图选项

深圳市龙岗区急性腹泻患者中ETEC的检出率为5.8%，与浙江省报道的检出率(4.0%)相似^[10]，感染以19~35岁的中青年为主，与其他研究结果一致^[5-7]。20102015年各年间ETEC的检出率差异无统计学意义，提示近6年本地区人群ETEC的感染水平较稳定。本地区ETEC以estIb毒力基因型流行为主，与全球范围内的流行趋势一致^[4]。菌株的血清型多样化，优势血清型为O148、0159、O25，与华南地区的研究结果一致^[11]，同时也出现国内外较少见的血清型，如O1、O111、O28a。散发腹泻患者ETEC的毒力基因分布在性别、年龄上差异无统计学意义，与Dutta等^[12]报道结果一致，可能样本量较小导致，有待扩大样本量，进一步研究毒力基因分布与性别、年龄的关系。

PFGE分子分型结果显示，深圳市龙岗区腹泻人群感染的ETEC基因型具多态性，菌株间的同源性不高，结果与其他研究结果相同^[10-13]。结合流行病学资料，发现P20、P22型对应的病例在发病时间和空间上具有聚集现象，但患者饮食史不详，未能判断是否具有共同的暴露史，需进行详细的流行病学调查追踪，才能明确是否发生了潜在的暴发感染。在不同年份不同患者中检出同一PFGE带型的ETEC，与刘凯等^[14]在不同年份腹泻人群中检出同一PFGE的EPEC的结果类似，提示某些基因型的ETEC可能会存在某些遗传比较稳定菌株，它们会长期存在环境中，进而引起散发腹泻。

根据Tenover等^[15]和Talon等^[16]的解释，若两菌株相似度为100.0%，在流行病学上属于相同事件，即为同源菌株。但由于细菌基因存在高度的变异性，判断是否为同一菌株允许一定的变异性存在，故相似度≥90%者存在非常近的亲缘关系，可认为是同源克隆菌株。结果显示本地区内可能存在10个ETEC克隆株，C、G克隆株为流行的主要克隆株。从时间分布上分析，C和G克隆株在2011年58月连续检出，最近的检出时间为2015年10月，G克隆株近几年均有引起散发病例，提示C、G型克隆株可在人群中引起持续性感染。李迎慧等^[17]对深圳市2014年收集的产毒大肠埃希菌进行PFGE分型，只在O148、0159、O25血清型的菌株中检出一致带型，与本研究结果一致，并且本地区ETEC的优势克隆株(C、G)的血清型均属于这3种，提示O148、0159、O25血清型的菌株存在一定的暴发风险，需加强关注。总体来看，近6年ETEC的感染高度散发，但菌株间的遗传关系仍存在紧密的联系。

PFGE被认为是细菌分型的“金标准”^[18]，是食物中毒事件中追溯传染源的有效手段。运用PFGE分析散发菌株间的同源性，对带型相同的散发病例进行主动的流行病学追踪和调查，判断是否发生了局部地区的暴发感染，可提高疾病主动监测的能力^[19]。在本研究中，发现某些带型在发病时间和地区上具有聚集性，相同带型对应的患者之间是否存在同源性感染，需进一步的流行病学追踪溯源。提高PFGE分型的时效性，及时对散发分离株进行PFGE同源分析，可以提高发现疾病暴发的能力，实现预警。