副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种嗜盐的革兰阴性菌，广泛分布于水生环境及无脊椎动物中，也是常见的食源性致病菌。与引起人类胃肠炎的临床分离株相比，环境分离株普遍缺乏耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、TDH相关溶血素(TDH-related hemolysin，TRH)等致病性蛋白的编码基因tdh和trh等^[1-3]，因此tdh和trh成为鉴别副溶血弧菌致病性的重要标志物。

副溶血弧菌最早发现于1953年，1963年由Sakazaki等^[4]正式命名，此后一直在世界范围内呈现由不同血清型引起的散发特征。1996年Okuda等^[5]首次报道了O3∶K6血清型副溶血弧菌引起的胃肠炎的流行,此后其发病率在世界范围内显著增高，此后又陆续发现了O4∶K68、O1∶K25、O1∶K26、O1∶KUT(O1∶K untypeable)等共14种高致病性的血清型，共同命名为“大流行菌群”(pandemic group)^[6-7]。这些大流行菌株的共同特点除了致病性基因trh阴性和tdh阳性等特征之外，还有特征性的独有序列ToxR/new，位于基因toxRS操作子。因此基于此序列的群特异性PCR即GS-PCR是大流行菌群的主要鉴定依据^[8-9]。

近年来副溶血弧菌，特别是大流行菌群严重威胁食品安全和人民健康^[10-12]。为了快速准确的鉴定副溶血弧菌大流行菌群并了解其致病性，本研究结合了编码致病因子TDH和TRH的基因tdh和trh序列以及GS-PCR所常用的toxRS基因序列，建立了一种快速方便地对副溶血弧菌大流行菌群以及毒力基因准确鉴定的多重PCR方法。

本实验所用副溶血弧菌临床分离株UP8(O1∶K6血清型，tdh阳性,trh阳性)及大流行株FR2(O3∶K6血清型，tdh阳性)由国家食品风险评估中心提供。副溶血弧菌临床分离株为本实验保存。大肠埃希菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、志贺菌、单核细胞增生性李斯特菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌(非大流行株)等对照菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心。

选取对数生长期的平板菌落，用细菌DNA提取试剂盒(北京卓诚惠生生物科技有限公司)提取细菌基因组DNA。操作步骤参照试剂盒说明书进行。

参照NCBI中GS-PCR特征基因toxRS,以及致病因子编码基因tdh和trh序列，用Primer 5.0软件设计特异性引物。引物序列用BLAST在线比对GenBank数据库，未发现与其他物种有非特异结合。tdh、toxRS和trh 目的条带大小分别为：269 bp、509 bp和653 bp，GS-PCR上下游引物位于参考序列(根据文献报道选用GenBank accession no.L11929)576位和1196位的两个大流行群固有的变异位点，经过primerBLAST验证，引物仅识别大流行菌群，而不识别非大流行的副溶血弧菌toxRS序列。为了提高大流行菌群鉴定的特异性，将大流行菌群特异碱基设于引物3′端第一位。引物由Introvigen合成。引物序列见表 1。

用TaKaRa Taq HS(TaKaRa)按试剂盒说明书建立每反应25 μl的多重PCR反应体系。每条引物工作浓度均为200 nmol/L，每反应加入2 μl 所提取的细菌DNA，反应条件：预变性95 ℃ 5 min；循环温度为94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 60 s；重复30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

PCR产物使用QIAxcel(QIAGEN)系统进行全自动电泳分析。具体参数：电泳卡夹选用QIAxcel DNA Screening Kit，分析方法选择AM420，用Size Marker 100 bp~1.5 kb和Alignment Marker 15 bp/2 kb作为分子质量参比。

为了验证多重PCR体系的特异性和准确性，从非大流行的临床分离株UP8和大流行菌株FR2中分别提取核酸，同时也从其他食源性致病菌，包括大肠埃希菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、志贺菌、单核细胞增生性李斯特菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、阪崎肠杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌中以同样的方法提取核酸作为阴性对照。所有的样本核酸在相同的条件下构建多重PCR反应体系比较PCR产物。

为了验证多重PCR体系的灵敏度，对2个阳性菌株，非大流行临床分离株UP8和大流行株FR2，分别用PBS建立10倍梯度稀释的菌悬液(10⁸CFU/ml~10⁴ CFU/ml)离心收集菌体并提取核酸，用多重PCR体系扩增并电泳检测条带。

待测菌株分别接种于两管3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养。分别用日本生研株式会社的血清鉴定11种O抗原和74种K抗原。

用参考菌株所提取的DNA对引物特异性进行评价的结果：副溶血弧菌临床分离株UP8的基因组中可特异性扩增出269 bp的tdh条带和509 bp的trh条带。副溶血弧菌大流行株FR2可特异扩增出653 bp的GS-PCR条带的同时，也可扩增出269 bp的tdh条带，但未扩出trh条带。非大流行株的副溶血弧菌无653 bp的GS-PCR条带。其他食源性致病菌，如大肠埃希菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、志贺菌、单核细胞增生性李斯特菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、溶藻孤菌、小肠结肠炎耶尔森菌等，也无相应扩增产物，见图 1。因此该组引物特异性强，可用于PCR检测副溶血弧菌大流行株及其毒力基因。

图 1 引物特异性验证的PCR产物全自动电泳结果 Figure 1 Automated electrophoresis results of PCR products for primer specificity

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本实验对副溶血弧菌临床分离株UP8(tdh与trh阳性)的鉴定灵敏度可达10⁵ CFU/ml。对大流行株的鉴定灵敏度也能达到10⁵ CFU/ml，见图 2。

图 2 灵敏度验证的PCR产物全自动电泳结果 Figure 2 Automated electrophoresis results of PCR products for specificity

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用建立的多重PCR方法对实验室保存的224株食品分离株和3株临床分离株副溶血弧菌进行鉴定。从5株食品分离株中鉴定到大流行菌群标志toxRS。其中3株为tdh阳性、trh阴性，2株为tdh阴性、trh阴性。血清学鉴定发现除1株tdh阳性株为O2∶KUT型以外，其余4株均为大流行菌群最常见的O3∶K6型。而本研究的临床分离株中未发现tdh、trh和大流行菌群的分子标记物,见表 2和图 3。

图 3 副溶血弧菌分离株鉴定结果 Figure 3 Electrophoresis results in identification of V. parahaemolyticus isolates

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副溶血弧菌广泛存在于水体中和无脊椎动物体内，在食物中具有极高的检出率。其中大流行菌群更是近年来危害食品安全和公共卫生的严重问题。因此高效灵敏地检测副溶血弧菌，并对其致病性进行鉴别，具有重要的现实意义。

多重PCR方法可以通过简单的操作，一次性检出多个检测靶标，因此常用于多病原检测或者单病原多致病基因检测^[13-14]。本实验针对副溶血弧菌大流行株的标识基因toxRS及与副溶血弧菌致病的毒力基因trh和tdh设计引物，并优化退火温度等反应条件，实现了副溶血弧菌大流行株及其毒力基因的同步检测。方便操作，快速准确且灵敏度较高，可以满足食品安全和公共卫生工作的大量样本检测需求。

携带tdh或trh的菌株被认为是致病性菌株，目前认定tdh和trh为副溶血弧菌的主要致病因子。通常认为这2个基因在环境分离株中很少出现，但在临床分离株的携带率较高，是鉴别副溶血弧菌致病性最常用的检测标志物。1996年以来高致病性血清型在世界范围内的大流行，使副溶血弧菌的“大流行菌群”引起了更加广泛的关注，这些血清型经过验证，发现是由原始 O3∶K6 菌株通过基因重组或水平转移等方式演变而来的新的变种^[15-16]。这些大流行菌株共同的特点是致病性较强、trh阳性、trh阴性。本实验室不仅分别分离到trh阳性、trh阴性的副溶血弧菌大流行株，而且发现了tdh阴性、trh阴性的大流行菌株。此外，血清学鉴定还发现了大流行株罕有报道的O2∶KUT血清型，该型虽然有报道发现于海产品和海洋环境中，但多为tdh阴性和trh阳性^[17]，在食品卫生监测中该型也通常不引起重视^[18]，而该分离株的致病基因也符合大流行菌群常见特征(trh阳性、trh阴性，见表 2)。此外，在本研究的临床分离株中，并未检测到大流行菌群标志基因toxRS以及致病基因trh和tdh。

通过本研究可以发现日常食品特别是水产品中存在威胁人群健康的副溶血弧菌大流行菌群。大流行菌群的致病基因分布会发生变化，GS-PCR阳性菌群中也会出现不常见的trh和tdh双阴性菌株。而血清型分布则更为复杂，一些未报道或极少报道与大流行菌群相关的血清型也可能会出现。因此血清型鉴定并不能直观而准确的反应副溶血弧菌的致病性和分类学特征，如本研究中出现的O2∶KUT血清型等。而非大流行菌群的副溶血弧菌也有造成散发的胃肠道疾病的可能。

本报道建立的副溶血弧菌大流行株及毒力基因多重PCR检测方法，实现多个基因的一次性同时扩增，敏感特异，简便有效。可以用于大量样本的快速检测。简便直观的从基因水平反映出副溶血弧菌的致病性等关键特征，满足食品卫生监测的需求。