疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (10): 824-830

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许美燕, 蔡茂荣, 胡慧玲, 林淑银
XU Mei-yan, CAI Mao-rong, HU Hui-ling, LIN Shu-yin
2013-2014年漳州市手足口病的病原学特征及分子流行病学研究
Etiology and molecular epidemiology of hand, foot and mouth disease in Zhangzhou, 2013-2014
疾病监测, 2016, 31(10): 824-830
Disease Surveillance, 2016, 31(10): 824-830
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.10.007

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收稿日期：2016-03-30
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许美燕, 蔡茂荣, 胡慧玲, 林淑银. 2013-2014年漳州市手足口病的病原学特征及分子流行病学研究[J]. 疾病监测, 2016, 31(10): 824-830.
XU Mei-yan, CAI Mao-rong, HU Hui-ling, LIN Shu-yin. Etiology and molecular epidemiology of hand, foot and mouth disease in Zhangzhou, 2013-2014[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(10): 824-830.
2013-2014年漳州市手足口病的病原学特征及分子流行病学研究
许美燕, 蔡茂荣, 胡慧玲, 林淑银     
漳州市疾病预防控制中心, 福建 漳州 363000
收稿日期: 2016-03-30
作者简介: 许美燕, 女, 福建省龙海市人, 硕士, 主管技师, 主要从事流感、手足口病、麻疹和风疹等病原微生物的监测工作
通信作者: 蔡茂荣, Tel:0596-2092356, Email:zzcdc.cmr@163.com.
摘要: 目的 了解2013-2014年漳州市手足口病的病原构成及分子流行病学特征，为漳州市手足口病的防治工作提供科学依据。 方法 采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）方法，检测2013-2014年漳州市哨点医院送检的1421份临床诊断手足口病疑似病例的标本，进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）的核酸检测；通过RT-PCR方法，扩增VP1区基因部分片段并测序，对非EV71及非Cox A16的肠道病毒进行分型鉴定；扩增完整VP1区基因片段并测序，构建系统进化树对EV71、Cox A16、Cox A6和Cox A10进行基因进化分析。 结果 1063份标本肠道病毒通用型阳性，阳性率为74.81%，其中222份标本EV71阳性，340份Cox A16阳性，8份EV71+Cox A16阳性，493份非EV71及非Cox A16的肠道病毒阳性。随机抽取40份非EV71及非Cox A16的肠道病毒阳性标本经RT-PCR和测序进一步分型，共鉴定出38份非EV71及非Cox A16的肠道病毒，其中Cox A6型25份（65.79%，25/38），Cox A10型8份（21.05%，8/38），Cox A5型1份（2.63%，1/38），Cox A4型3份（7.89%，3/38）和Cox A9型1份（2.63%，1/38）。VP1区完整基因的进化分析显示，漳州市的EV71均属C4基因亚型的C4a进化分支，Cox A16分属B1基因亚型的B1a和B1b两个分支；Cox A6和Cox A10均与原型株及国外地区分离株的亲缘关系远，与国内地区分离株的亲缘关系近。 结论 2013-2014年漳州市非EV71及非Cox A16的肠道病毒在手足口病病原谱中占有重要位置；非EV71及非Cox A16的肠道病毒型别多样，Cox A6和Cox A10为其中的优势型别。漳州市的EV71、Cox A16、Cox A6和Cox A10标本在进化树上与国内地区相应分离株共进化共循环。
关键词： 手足口病     病原学     分子流行病学分析    
Etiology and molecular epidemiology of hand, foot and mouth disease in Zhangzhou, 2013-2014
XU Mei-yan, CAI Mao-rong, HU Hui-ling, LIN Shu-yin     
Zhangzhou Prefecture Center for Disease Control and Prevention, Zhangzhou 363000, Fujian, China
Corresponding author: CAI Mao-rong, Email:zzcdc.cmr@163.com.
Abstract: Objective To explore the pathogenic spectrum and molecular epidemiology characteristics of hand foot and mouth disease (HFMD) in Zhangzhou, Fujian province, during 2013-2014 and provide evidence for the prevention and treatment of HFMD. Methods During this period, a total of 1421 samples were collected from clinical diagnosed HFMD cases in sentinel hospitals in Zhangzhou for EV71, Cox A16 and other enterovirus detection with real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Real-time RT-PCR). The genotyping of non-EV71 and non-Cox A16 enteroviruses through sequencing partial VP1 coding gene were performed by RT-PCR. Full-length coding regions for the VP1 genes of EV71, Cox A16, Cox A6 and Cox A10 were amplified and sequenced to construct phylogenetic trees for phylogenetic analysis. Results Among the samples tested, 1063 were positive for enteroviruses (74.81%), including 222 EV71 positive samples, 340 Cox A16 positive samples, 8 EV71+Cox A16 positive samples and 493 non-EV71or non-Cox A16 enterovirus positive samples. Forty non-EV71 and non-Cox A16 enterovirus positive samples were selected randomly for further analysis by RT-PCR and sequencing, and among the 38 samples with definite results, 25 were Cox A6 positive (65.79%), 8 were Cox A10 positive(21.05%), 3 were Cox A4 positive (7.89%), 1 was Cox A5 positive (2.63%) and 1 was Cox A9 positive (2.63%). The phylogenetic analysis indicated that all the EV71 strains belonged to evolutionary branch C4a of gene subtype C4, and Cox A16 strains belonged to evolutionary branch B1a and B1b of gene subtypes B1. Phylogeneic analysis also indicated that Cox A6 and Cox A10 strains from Zhangzhou shared low homology with prototype strains and foreign strains but high homology with domestic strains. Conclusion Non-EV71 and non-Cox A16 enterovirus accounted for a high proportion in the pathogen spectrum of HFMD in Zhangzhou during 2013-2014. Five serotypes of non-EV71 and non-Cox A16 enteroviruses were successfully identified, and Cox A6 and Cox A10 were predominant. Phylogenetic analysis showed that EV71, Cox A16, Cox A6 and Cox A10 co-circulated and co-evolved with the strains detected both at home and abroad in Zhangzhou.
Key words: Hand foot and mouth disease     Etiology     Molecular epidemiology    

手足口病(hand foot mouth disease，HFMD)是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。

引起HFMD的病原组成较为复杂，包括人肠道病毒71型(EV71)，柯萨奇病毒A组(Cox A2~12、Cox A16和Cox A20)和B组(Cox B1~6)及部分埃可病毒(E3、E4、E5、E6、E9、E11、E18、E25和E30)[1]。目前HFMD常规病原学监测只要求检测肠道病毒通用型、EV71和Cox A16，对引发HFMD的非EV71和非Cox A16的肠道病毒未做进一步的型别鉴定。而近年来的研究报告显示，非EV71及非Cox A16的肠道病毒在HFMD病原谱中的比例日渐增加，为全面了解本地区HFMD的病原构成情况，本研究通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，Real-time RT-PCR)、反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增肠道病毒VP1基因并测序，确定病原体，并通过构建系统进化树对病原体进行分子流行病学分析。

1 材料与方法 1.1 标本采集

按照卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2009年版)执行。根据该指南的病原学监测要求，以县(区)为单位，每月至少采集5例首次就诊的HFMD普通病例标本。当月县(区)病例总数少于5例时，全部采样。漳州市共11个县(区)，每个县(区)1个监测点医院，市区另设1个监测点医院，共12个监测点医院。采集发病3 d内的患者咽拭子或肛拭子标本。标本采集后，立即置3~5 ml采样液中。2013-2014年共采集12个监测点医院临床诊断HFMD疑似病例的标本1421份。

1.2 病毒RNA的提取

采用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒进行病毒RNA提取。

1.3 Real-time RT-PCR

采用江苏硕世肠道病毒通用型、EV71、Cox A16荧光PCR检测试剂盒对标本RNA进行Real-time RT-PCR检测。该反应在ABI7500荧光定量PCR仪上进行。

1.4 基因扩增及序列测定 1.4.1 EV71和Cox A16 VP1区基因全长扩增

从不同县(区)的EV71和Cox A16核酸阳性标本中，每年各随机抽取5份，采用QIAGEN one step RT-PCR试剂盒进行VP1区基因全长扩增。引物序列为：EV71-VP1-A：5'-AAG TCG CGA GAG CTG TCT TC-3'，EV71-VP1-S：5'-GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC-3'；Cox A16-VP1-S：5'-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3'，Cox A16-VP1-A：5'-GCT GTC CTC CCA CAC AAG AT-3'。RT-PCR反应条件：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 80 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物约为1100 bp，包括VP1区全长基因。该反应在Eppendorf Mastercycler pro PCR仪上进行。

1.4.2 非EV71及非Cox A16的肠道病毒分型

从不同县(区)的肠道病毒通用阳性而EV71和Cox A16均阴性的标本中，每年随机抽取20份，采用QIAGEN one step RT-PCR试剂盒进行VP1区基因5'端核苷酸扩增。用于扩增VP1区的相关引物名称为[2-4]：222/292，HEV-A的特异性引物486/488，HEV-B的特异性引物490/492，AN88/AN89。RT-PCR反应条件：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.4.3 Cox A6和Cox A10 VP1区基因全长扩增

根据非EV71及非Cox A16的肠道病毒分型结果，随机抽取Cox A6和Cox A10各4份，使用半巢式RT-PCR进行VP1区基因3'端核苷酸扩增。使用引物[2, 5]：第1步RT-PCR反应使用引物EUC2/EUG3(EUG3为根据EUG3a、EUG3b和EUG3c序列合成的简并引物)；第2步RT-PCR反应以第1步RT-PCR的产物为模板，使用引物EUG3/489。将Cox A6和Cox A10的VP1区两部分基因：486/488测序结果即VP1区基因5'端，EUG3/489测序结果即VP1区基因3'端，分别进行拼接后获得VP1区基因全长。

1.4.4 扩增产物的纯化及测序

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用QIA quick Gel extraction Kit回收纯化目的条带。纯化后的扩增产物按TaKaRa pMDTM 18-T Vector Cloning Kit说明连接至pMD18-T载体，转化至DH5α感受态细胞，重组克隆经RV-M和M13-47通用引物鉴定。用TIANGEN公司质粒提取试剂盒提取重组阳性克隆质粒送invitrogen公司测序。

1.4.5 肠道病毒病原体的确定及VP1

区基因全长序列分析所有的VP1基因序列使用HEV在线分型工具(www.rivm.nl/mpf/enterovirus/typingtool)进行型别鉴定。Cox A6和Cox A10的测序结果采用DNAStar 5.00软件中的Seqman程序进行拼接组装成完整的VP1基因序列。全部核苷酸和氨基酸的序列分析和同源性比较应用DNAStar软件中的MegAlign完成，系统进化树构建应用Mega 4.0软件完成。所有参考序列均来自GenBank。

2 结果 2.1 Real-time RT-PCR检测结果

2013-2014年共对1421份疑似HFMD标本进行肠道病毒通用型、EV71和Cox A16的核酸检测，结果见表 1。不同年份之间不同型别检测结果差异有统计学意义(χ2 =160.04，P=0.00)。

表 1 2013-2014年漳州市HFMD标本的Real-time RT-PCR检测结果 Table 1 Real-time RT-PCR results of HFMD samples in Zhangzhou, 2013-2014
年份 标本数 肠道病毒通用型
核酸检测		 EV71 Cox A16 EV71和Cox A16
混合感染		 其他肠道病毒阳性
阳性数 阳性率
(%)		 阳性数 阳性率
(%)		 阳性数 阳性率
(%)		 阳性数 阳性率
(%)		 阳性数 阳性率
(%)
2013 622 480 77.17 91 14.63 72 11.58 0 0.00 317 50.96
2014 799 583 72.97 131 16.40 268 33.54 8 1.00 176 22.03
合计 1421 1063 74.81 222 15.62 340 23.93 8 0.56 493 34.69
表选项
2.2 非EV71及非Cox A16的肠道病毒分型

从不同县(区)的肠道病毒通用型阳性而EV71和Cox A16均阴性的标本中，每年随机抽取20份，共40份标本进行分型鉴定，成功鉴定38份，2份未能分型，结果为：Cox A6占65.79%(25/38)，Cox A10占21.05%(8/38)，Cox A5占2.63%(1/38)，Cox A4占7.89%(3/38)，Cox A9占2.63%(1/38)。

2.3 EV71和Cox A16 VP1区基因全长序列同源性比较和系统进化分析

2013-2014年对EV71和Cox A16标本各10份进行VP1区基因全长扩增和测序，获得覆盖VP1区基因全长的1100 bp序列后，利用Clustal X 1.83软件进行VP1区基因序列位置的确定，用BioEdit 7.0软件对序列进行剪切，结果均获得891 bp的VP1区全长核苷酸序列。系统进化树显示(图 1)：漳州市的10个EV71 VP1区基因全长序列均集中于C4基因亚型的C4a进化分支；漳州市的10个Cox A16 VP1区基因全长序列均属于B1基因亚型，在进化树中分别归属于两支，其中9份标本与H573F-SD-CHN-2008、EV218-GD-CHN-2014等中国内地分离株构成亲缘关系较近的一支，均属于B1基因亚型的B1b分支，ZZ14-420-FJ-CHN-2014标本与江苏南京2013年的分离株DC13-012-NJ-CHN-2013亲缘关系较近，属于B1基因亚型的B1a分支。

图 1 基于EV71和Cox A16的完整VP1区核苷酸序列(891 bp)构建的系统进化树 Figure 1 Phylogenetic trees based on entire VP1 nucleotide sequences (891 bp) of EV71 and Cox A16 注：(a)●漳州市2013-2014 EV71阳性病毒，○EV71原型株BrCr，■外群Cox A16 G10；(b)●漳州市2013-2014 Cox A16阳性病毒，○Cox A16原型株Cox A16 G10，■外群EV71 BrCr。
图选项
2.4 Cox A6和Cox A10 VP1区基因全长序列同源性比较和系统进化分析

本研究从Cox A6阳性标本中随机抽取4份标本进行完整VP1区基因的扩增测序，获得的Cox A6完整VP1区基因序列全长均为915 bp，与Cox A6的原型株Gdula相比，未发现核苷酸的缺失和插入。将漳州市的4个Cox A6 VP1区基因全长序列与GenBank检索的29株Cox A6型病毒代表株构建基于完整VP1区基因的系统进化树(图 2)，并进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。漳州市4份CoxA6标本之间核苷酸和氨基酸同源性分别为94.1%～98.0%和97.4%～98.7%；与原型株Gdula的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为82.3%～82.7%和94.1%～95.1%。由于目前对Cox A6的基因分型没有明确的标准或共识，本研究参照VP1区核苷酸同源性高于85%的毒株为同一基因型，同源性高于91%的毒株为同一基因亚型这一标准[6]，结合进化树分析，将Cox A6分为4个基因型：A、B、C、D。D基因型又分为D1～D3基因亚型，Cox A6同一基因型内核苷酸序列同源性均 > 85.0%(A、B基因均为单一菌株，无法比较；C内部为90.8%，D内部为89.3%～100.0%)，同一基因亚型内核苷酸序列同源性均 > 91.0%(D1内部为94.1%～100.0%，D2内部为95.8%～97.2%，D3内部为93.4%～96.0%)，详见表 2。漳州市的4个Cox A6 VP1区基因全长序列均分布在D1基因亚型中，进化树显示，漳州市4个Cox A6标本与原型株Gdula、国内地区两株山东分离株(92022-SD-CHN-1992，96188-SD-CHN-1996)及印度株(N-313-IND)等年代较为久远的分离株遗传距离较远，亲缘关系远，与国内近年来流行的分离株的遗传距离近，亲缘关系近。

表 2 Cox A6基因(亚)型内及基因(亚)型间VP1区核苷酸序列的同源性(%)比较分析 Table 2 Intra and inter subtype comparison of homology of nucleotide sequence of VP1 regions of Cox A6
Cox A6基因
(亚)型		 A B C D D1 D2 D3
A
B 85.0
C 83.0～83.4 82.6～83.3 90.8(1)
D 80.9～83.5 82.2～84.2 83.9～86.4
89.3～100.0(1)
D1 94.1～100.0(1) 89.3～92.2 90.2～95.8
D2 95.8～97.2(1) 89.7～93.6
D3 93.4～96.0(1)
注：(1)为同基因(亚)型内毒株间VP1区核苷酸序列的同源性；其他为不同基因(亚)型毒株间VP1区核苷酸序列的同源性。
表选项
图 2 基于Cox A6的完整VP1区核苷酸序列(915 bp)构建的系统进化树 Figure 2 Phylogenetic tree based on entire VP1 nucleotide sequence (915 bp) of Cox A6 strains 注：●为漳州市2013-2014年Cox A6阳性病毒；○为Cox A6原型株Gdula。
图选项

同样，本研究从Cox A10阳性标本中随机抽取4份标本进行完整VP1区基因的扩增测序，获得的Cox A10完整VP1区基因序列全长均为894 bp。将漳州市的4个Cox A10 VP1区基因全长序列与GenBank检索的28株Cox A10型病毒代表株构建基于完整VP1区基因的系统进化树(图 3)，并进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。漳州市的4份Cox A10标本之间核苷酸和氨基酸同源性分别为95.6%～99.7%和97.3%～99.7%；与原型株Kowalik的核苷酸和氨基酸同源性分别为76.7%～77.2%和91.6%～92.6%。目前对Cox A10的基因分型没有明确的标准或共识，本研究综合VP1区核苷酸同源性及遗传进化树分析的结果，将Cox A10分为4个基因型(A、B、C、D)。D基因型内部的核苷酸序列同源性为94.0%～100.0%，亲缘关系近，不划分基因亚型，但至少可以看出有L1～L4共4个独立的分支；Cox A10同一基因型内核苷酸序列同源性均>85.0%(A基因均为单一菌株，无法比较；B基因内部为96.6%～99.1%，C内部为95.5%～96.8%，D内部为94.0%～100.0%)，详见表 3。原型株Kowalik单独分布在A基因型，B基因型主要由西班牙、法国等国家的分离株组成，中国山东、深圳、河北和江苏等地区所有的Cox A10分离株分布在C和D基因型中。漳州市的4个Cox A10 VP1区基因全长序列均分布在D基因型中，与原型株Kowalik的遗传距离较远，亲缘关系远，而与国内地区如山东WD0048-SD-CHN-2009、深圳SHZH12-JB141230348-CHN-2012、江苏M10F74-JS-CHN-2010等分离株的亲缘关系近。

图 3 基于Cox A10的完整VP1区核苷酸序列(894 bp)构建的系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree based on entire VP1 nucleotide sequence (894 bp) of Cox A10 strains 注：●为漳州市2013-2014年Cox A10阳性病毒；○为Cox A 10原型株Kowalik。
图选项
表 3 Cox A10基因型内及不同基因型间VP1区核苷酸序列的同源性(%)比较分析 Table 3 Intra and inter subtype comparison of homology of nucleotide sequence of VP1 regions of Cox A10
Cox A10基因型 A B C D
A
B 75.1～76.5 96.6～99.1(1)
C 75.7～76.1 78.9～81.2 95.5～96.8(1)
D 76.3～77.4 79.0～81.3 81.2～84.2 94.0～100.0(1)
注：(1)为同基因型内毒株间VP1区核苷酸序列的同源性；其他为不同基因型毒株间VP1区核苷酸序列的同源性。
表选项
3 讨论

在国内外早期HFMD病原学研究中，EV71和Cox A16是其主要病原体，但近年来随着对病原学研究的深入，认为除了EV71和Cox A16外，其他肠道病毒型别在HFMD病原谱中也占有重要位置。HFMD疫情监测数据显示，在2008-2010年间，引起福建省HFMD的主要病原体为EV71和Cox A16，2008年和2009年其他肠道病毒引起福建省HFMD病例的比例只有1.0%，2010年占2.8%，但是近几年其他肠道病毒的构成比例明显上升，2011-2015年分别为26.5%、32.2%、65.7%、41.8%和59.3%。2012-2014年江苏省太仓市其他型别肠道病毒逐年出现的构成比分别为17.6%、66.7%和42.5%[7]，广西地区HFMD轻症病例中，2008年其他型别肠道病毒构成比占52.7%，而2013年则增加至61.8%[8]。本研究对漳州市的2013-2014年1421份疑似HFMD标本进行肠道病毒通用型、EV71和Cox A16的核酸检测，发现2013年HFMD病原体主要为非EV71及非Cox A16的肠道病毒，阳性率高达50.96%，而2014年HFMD病原体主要为Cox A16(阳性率为33.54%)，其次为非EV71及非Cox A16的肠道病毒(阳性率为22.03%)。说明在漳州市其他的肠道病毒型别在HFMD病原谱中同样占有重要位置。进一步的分型鉴定发现，非EV71及非Cox A16的肠道病毒中，以Cox A6(65.79%，25/38)和Cox A10(21.05%，8/38)为主，偶见Cox A5、Cox A4和Cox A9。陈炜等[9-10]对福建省2011-2014年其他肠道病毒HFMD标本进行分离鉴定，共鉴定出Cox A2、Cox A4~6、Cox A8~10、Cox A12、Cox A21，Cox B1~5、E3、E6、E7、E9、E16、E25、E30和EV68 22种肠道病毒，其中以Cox A6和Cox A10为优势毒株，其构成比分别为48.9%和25.3%，该结果与2009年河北、2013年广州、2012年北京、2010年上海等地区的HFMD病原谱的构成情况相似[11-14]，Cox A6、Cox A10成为HFMD重要的病原之一。由此可见，HFMD的病原组成已呈现多样化和复杂性的特点，在其他肠道病毒中，Cox A6和Cox A10也占较大比例。

EV71系统进化树结果显示，漳州市2013-2014年的10个EV71 VP1区基因全长序列均集中于C4基因亚型的C4a进化分支，与2004年以来中国大陆EV71流行的基因型完全一致。Cox A16系统进化树结果显示，漳州市2013-2014年的10个Cox A16 VP1区基因全长序列均属于B1基因亚型，在进化树中分别归属于B1a和B1b两支，说明目前B1a和B1b这两条进化分支在漳州市共同流行，与近年来国内有关Cox A16分子进化方面研究结果一致。对Cox A6和Cox A10进行进一步基因分型目前并没有明确的标准或共识，本研究参照VP1区核苷酸同源性高于85%的毒株为同一基因型，同源性高于91%的毒株为同一基因亚型这一标准[6]，结合进化树分析，将Cox A6和Cox A10都分为A、B、C、D 4个基因型，基因分型结果与Tan等[15]和Tian等[16]对于Cox A6、Cox A10的基因分型结果基本一致。漳州市2013-2014年的4个Cox A6 VP1区基因全长序列和4个Cox A10 VP1区基因全长序列均与原型株遗传距离较远，亲缘关系远，与国内近年来流行的分离株的遗传距离近，亲缘关系近，可见，漳州市的Cox A6和Cox A10毒株在进化上并不是独立的，而是与国内地区(如江苏、深圳等)的毒株共进化共循环的。

作者贡献:

许美燕：项目设计和论文撰写

蔡茂荣、胡慧玲、林淑银：论文撰写

参考文献
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