疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (10): 870-874

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吕冰, 张新, 黄瑛, 霍达, 严寒秋, 王全意, 曲梅
LYU Bing, ZHANG Xin, HUANG Ying, HUO Da, YAN Han-qiu, WANG Quan-yi, QU Mei
北京地区2010-2015年宋内志贺菌脉冲场凝胶电泳分型及耐药特征分析
Pulsed field gel electrophoresis typing and drug resistance detection of Shigella sonnei isolated in Beijing, 2010-2015
疾病监测, 2016, 31(10): 870-874
Disease Surveillance, 2016, 31(10): 870-874
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.10.016

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收稿日期：2016-02-17
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吕冰, 张新, 黄瑛, 霍达, 严寒秋, 王全意, 曲梅. 北京地区2010-2015年宋内志贺菌脉冲场凝胶电泳分型及耐药特征分析[J]. 疾病监测, 2016, 31(10): 870-874.
LYU Bing, ZHANG Xin, HUANG Ying, HUO Da, YAN Han-qiu, WANG Quan-yi, QU Mei. Pulsed field gel electrophoresis typing and drug resistance detection of Shigella sonnei isolated in Beijing, 2010-2015[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(10): 870-874.
北京地区2010-2015年宋内志贺菌脉冲场凝胶电泳分型及耐药特征分析
吕冰, 张新, 黄瑛, 霍达, 严寒秋, 王全意, 曲梅     
北京市疾病预防控制中心, 北京 100013
收稿日期: 2016-02-17
基金项目: 国家“十三五”科技重大专项（No.2016ZX10004215）；北京市高层次卫生技术人才培养计划（No.2013-3-099）
作者简介: 吕冰, 女, 黑龙江省哈尔滨市人, 博士, 副研究员, 主要从事腹泻病原菌的病原学研究工作
通信作者: 曲梅, Tel:010-64407115, Email:meiqu@126.com.
摘要: 目的 分析北京市2010-2015年分离的259株宋内志贺菌脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型及耐药特征。 方法 收集2010-2015年分离到的宋内志贺菌259株, 经生化及血清型鉴定后, 应用PFGE分型并用最小抑菌浓度法（minimal inhibition concentration，MIC）进行12种药物的耐药检测。 结果 259株宋内志贺菌经PFGE图谱聚类分析后，发现宋内志贺菌有A、B两个优势簇，2010-2015年A簇菌株所占构成比逐年增高；耐药结果显示257株为耐药菌株，其中245株为多耐药菌株，占所有耐药菌株的95.33%。对头孢曲松（CRO）的耐药性有明显升高。 结论 北京地区近年宋内志贺菌有较高的同源性，A簇菌株已经成为目前北京地区宋内志贺菌的优势簇。对三代头孢类药物CRO等耐药性上升可能与临床上大量应用三代头孢药物以及A簇菌株增多有关，多耐药谱的情况也更加复杂，提示应合理使用抗生素。
关键词： 宋内志贺菌     脉冲场凝胶电泳     细菌耐药性    
Pulsed field gel electrophoresis typing and drug resistance detection of Shigella sonnei isolated in Beijing, 2010-2015
LYU Bing, ZHANG Xin, HUANG Ying, HUO Da, YAN Han-qiu, WANG Quan-yi, QU Mei     
Beijing Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China
Corresponding author: QU Mei, Email:meiqu@126.com.
Abstract: Objective To understand the molecular and drug resistant characteristics of Shigella sonnei isolated in Beijing from 2010 to 2015. Methods A total of 259 Shigella sonnei strains isolated in Beijing from 2010 to 2015 were tested by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and the minimum inhibitory concentration of 12 antibiotics to the strains were detected after the serological and biochemical identification. Results PFGE results showed that the strains shared high homology (>90%) and cluster A and B were the two major subtypes. The proportion of the strains in cluster A increased from 2010 to 2015. There were 257 drug resistant strains and 245 multidrug resistant strains (95.33%). It was noticeable that the drug resistant rate to ceftriaxone was in increase. Conclusion Shigella sonnei isolated in Beijing from 2010 to 2015 shared high homology, and cluster A was the predominant subtype. The increased rate of drug resistance to ceftriaxone might be related with the common clinical use of three-generation cephalosporin and increase of the strains in cluster A. Multidrug resistance was more complex, suggesting the importance of rational use of antibiotics.
Key words: Shigella sonnei     Pulsed field gel electrophoresis     Drug resistance    

志贺菌是细菌性痢疾(菌痢)的病原菌，包括痢疾志贺菌、鲍氏志贺菌、福氏志贺菌和宋内志贺菌4群。人群普遍易感，严重影响人类健康。在发展中国家，菌痢是5岁以下儿童死亡的重要原因之一。在我国菌痢的发病也一直处于较高的水平。2005年8月卫生部发布了《全国细菌性痢疾监测方案》(试行)，在10个省市的20个县(市)设立了国家监测点，北京市被列为监测点之一。通过近10年全市痢疾监测，宋内志贺菌已经成为北京市痢疾病原菌的优势菌株，并且其耐药率一直处于较高水平[1]。本研究收集了2010-2015年北京市痢疾监测分离到的259株宋内志贺菌，采用分子分型及药物敏感性试验等方法，了解北京市宋内志贺菌流行趋势及耐药情况。

1 材料与方法 1.1 菌株来源

2010-2015年北京市痢疾监测中收集到的宋内志贺菌259株，所有菌株均分离自北京市肠道门诊的腹泻患者粪便标本。根据《国家霍乱痢疾监测方案北京实施办法》，全市16区均为监测点，每个监测点选取1~2家肠道门诊，每年4-10月完成患者粪便样本的检测，并上送分离到的病原菌。每年分离的菌株数见表 1。所有菌株经过法国生物梅里埃公司VITEK2-compact全自动微生物鉴定系统鉴定为志贺菌，并且经志贺菌检测血清(日本生研株式会社)进行血清型检测，确认为宋内志贺菌(生理盐水做对照)。

表 1 2010-2015年北京市宋内志贺菌12种抗生素耐药率(%) Table 1 Drug resistant rates of Shigella sonnei isolates of Beijing to 12 antibiotics, 2010-2015
抗生素 2010年
(n=30)		 2011年
(n=52)		 2012年
(n=13)		 2013年
(n=27)		 2014年
(n=77)		 2015年
(n=60)		 合计
(n=259)		 P值
AMP 93.30 94.20 100.00 88.90 90.90 98.33 93.82
AUG 93.30 92.30 100.00 88.90 61.00 95.00 83.70 < 0.05
CRO 23.30 34.60 7.70 33.30 14.30 71.67 34.36 < 0.05
FEP 3.30 5.80 0.00 11.10 0.00 13.33 5.79 < 0.05
FOX 0.00 0.00 0.00 0.00 1.30 0.00 0.39
IMP 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
TET 50.00 38.50 23.10 48.10 92.20 86.67 66.41 < 0.05
NAL 100.00 100.00 100.00 88.90 96.10 100.00 97.68
CIP 6.70 1.90 0.00 0.00 2.60 0.00 1.93
SXT 93.30 100.00 92.30 92.60 97.40 100.00 97.30
SUL 93.30 100.00 92.30 96.30 97.40 98.33 97.30
CHL 13.30 3.80 7.70 0.00 6.50 5.00 5.79
表选项
1.2 药物敏感性检测

药敏试验用最小抑菌浓度(minimal inhibition concentration，MIC)法，使用革兰阴性需氧菌药敏检测板(上海星佰生物技术有限公司)，药物应用氨苄西林(AMP)、阿莫西林-克拉维甲酸(AUG)、头孢曲松(CRO)、头孢吡肟(FEP)、头孢西丁(FOX)、亚胺培南(IMP)、四环素(TET)、萘啶酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、复方新诺明(SXT)、磺胺异恶唑(SUL)和氯霉素(CHL)12种药物进行药物敏感性检测，其结果按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)发布的标准判定[2]，以大肠埃希菌(ATCC25922)作为质控菌株。菌株的多耐药(MDR)、超耐药(XDR)及泛耐药(PDR)的判定参见2012年Magiorakos等[3]的著述。

1.3 脉冲场凝胶电泳(PFGE)

参考美国疾病预防控制中心PulseNet实验方法[4]，进行259株宋内志贺菌的PFGE分型。PFGE图像应用BioNumerics数据库软件进行处理，相似度系数设置为Dice(容许度设置为Opt：1.5%)，采用UPGMA方法进行聚类分析并且绘制树状图。

1.4 统计学分析

计算2010-2015年各年度每种药物的耐药率，并应用SPSS 21.0软件进行χ2检验，P < 0.05差异有统计学意义。

2 结果 2.1 药物敏感试验

药物敏感性实验结果见表 1。在259株宋内志贺菌中，只有2株对所有药物敏感，其他257株为耐药菌株，其中245株为MDR，占95.33%(245/257)。259株宋内志贺菌中未发现XDR及PDR菌株。对AMP、NAL、SXT、SUL的耐药率均超过90%，对CRO、FEP和TET的各年度耐药率差异有统计学意义。所有的多耐药菌株均对NAL耐药，NAL-SUL-SXT-AMP-AUG-TET耐药模式占比例最大(29.8%)；其次是NAL-SUL-SXT-AMP-AUG耐药模式，占21.22%；NAL-SUL-SXT-AMP-AUG-TET-CRO耐药模式，占20.00%，以及NAL-SUL-SXT-AMP-TET耐药模式，占7.35%；其余耐药模式所占比例＜5.00%，不一一列举。

2.2 PFGE分型

259株宋内志贺菌的PFGE分子分型结果经Bionumerics 5.0软件分析，绘制聚类图，见图 1。259株宋内志贺菌共分为72个PFGE带型，带型间相似度范围为98.0%~74.3%，有相同带型的菌株数量标注在菌株号右侧。根据以往的研究结果，带型相似度＞90%的菌株可划分为一簇[5-6]。由图 1可见259株宋内志贺菌有A、B两个优势簇，A、B两簇的相似度约为89.9%。A簇菌株178株占总菌株数68.7%；B簇菌株63株，占24.3%(图 2)。由图 2可见2010-2015年A簇菌株逐年升高至90%，而B簇菌株逐年缩减。

图 1 259株宋内志贺菌PFGE分型结果 Figure 1 Dendrogram of PFGE subtyping of 259 Shigella sonnei strains
图选项
图 2 2010-2015年北京市259株宋内志贺菌A、B两簇的构成比 Figure 2 Proportion of cluster A and B in 259 Shigella sonnei isolates, 2010-2015, Beijing 注：图中的数字表示该年度菌株中A、B两簇各占的菌株数。
图选项

表 2比较了A、B两簇菌株对12种药物的药物敏感性实验结果，AUG、CRO和TET三种药物耐药率差异有统计学意义，A簇菌株对CRO和TET的耐药率明显高于B簇，而B簇对AUG的耐药率高于A簇。

表 2 2010-2015年北京市宋内志贺菌A、B两簇菌株对12种药物耐药率比较 Table 2 Comparison of drug resistant rate of of Beijing Shigella sonnei isolates in cluster A and B to 12 antibiotics, 2010-2015
药物 A组耐药菌(%) B组耐药菌(%) P值
AMP 95.45 98.31
AUG 81.82 94.92 < 0.05
CRO 39.77 18.64 < 0.05
FEP 6.82 3.39
FOX 0.57 0.00
IMP 0.00 0.00
TET 72.73 49.15 < 0.05
NAL 98.86 100.00
CIP 1.14 0.00
SXT 99.43 100.00
SUL 98.86 100.00
CHL 4.55 5.08
表选项
3 讨论

发达国家细菌性痢疾的病原体以宋内志贺菌占优势[7]，而发展中国家一直以福氏志贺菌为主，但近年来宋内志贺菌在发展中国家的感染率有增高的趋势[8]。根据北京市以往的研究，从2009年后宋内志贺菌已成为北京地区的优势菌株[1, 9]。同痢疾志贺菌、福氏志贺菌相比，感染宋内志贺菌通常发病较温和，更容易在人群中播散[10]。北京地区人口多，人口密度相对集中，人员流动性比较大，宋内志贺菌的远距离播散也成为可能。根据本研究的结果，北京地区宋内志贺菌有A、B两簇优势菌株，但是两簇菌株PFGE图谱在树状图中计算的相似度比较高(89.9%), 存在较高的同源性。在以往的工作中，志贺菌多位点序列分析(multilocus sequence typing system，MLST)结果也得出相似的结论[11]。按照年度菌株分布来看A簇菌株逐年增多，到2015年A簇菌株达到90%以上，宋内志贺菌A簇已经成为目前北京地区宋内志贺菌的优势簇。虽然近年没有志贺菌感染集中暴发的事件，但是志贺菌的持续播散，也使得加强志贺菌分子流行病监测，了解流行趋势、控制疾病的传播具有重要的意义。

治疗菌痢的原则之一是正确合理选用抗生素，磺胺类药物和喹诺酮类药物是治疗菌痢的常用药，然而使用抗生素虽然对减轻临床症状、缩短病程有重要作用，同时也带来了病原菌耐药性增高的问题。据报道1998-2009年亚洲和非洲志贺菌对NAL和CIP的耐药率分别从33.6%和5.0%上升到64.5%和29.1%[12]。根据1990-2007年北京地区宋内志贺菌耐药性监测，CIP和氧氟沙星的耐药率无明显增长，而磺胺类药物、AMP和CRO耐药率有明显增高[13-14]，本次研究结果显示AMP及磺胺类药物耐药率已经超过95%，更为严重的是对CRO以及FEP快速增长的耐药率。近年来宋内志贺菌耐三代头孢菌素或产超广谱3-内酰胺酶的报告增多[15-18]，对β-内酰胺类药物包括AMP、哌拉西林、头孢噻肟及CRO耐药增加趋势明显，超过亚洲其他国家的监测数据和增长速度[19]。2009年鲍春梅等[20]已经发现宋内志贺菌在北京地区对三代头孢类药物的耐药率已达到73.3%，本研究也有相近的结果。可能和临床上大量应用三代头孢作为治疗首选药物有关。宋内志贺菌A、B两簇菌株对三代头孢类药物(CRO)的耐药率差异有统计学意义，A簇菌株的耐药率明显高于B簇。按照年度分布A簇菌株逐年增多，到2015年已高于90%，所以宋内志贺菌菌株A、B两簇的分布变化也是耐药率增高的重要原因。

根据2005年全国监测点的数据[21]，常见耐药谱AMP、NAL、TET、SXT耐药占17.2%；AMP、阿莫西林/克拉维酸、NAL、TET、SXT耐药占15%。而本研究中显示在2010年后多耐药率升高，耐药谱的情况也更加复杂，提示合理应用抗生素的必要性。

作者贡献:

吕冰：菌株分型结果分析及论文撰写

张新、黄瑛：菌株分子分型及生化分析

霍达：数据分析

严寒秋：志贺菌株的血清分析

王全意、曲梅：实验设计及数据分析

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