疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (11): 920-924

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赵宏群, 刁保卫, 杜小莉, 卢昕, 崔志刚, 阚飙, 逄波
ZHAO Hong-qun, DIAO Bao-wei, DU Xiao-li, LU Xin, CUI Zhi-gang, KAN Biao, PANG Bo
副溶血弧菌分子分型数据库建立与分析
Establishment of molecular typing database for Vibrio parahaemolyticus
疾病监测, 2016, 31(11): 920-924
Disease Surveillance, 2016, 31(11): 920-924
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.11.008

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收稿日期：2015-10-09
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赵宏群, 刁保卫, 杜小莉, 卢昕, 崔志刚, 阚飙, 逄波. 副溶血弧菌分子分型数据库建立与分析[J]. 疾病监测, 2016, 31(11): 920-924.
ZHAO Hong-qun, DIAO Bao-wei, DU Xiao-li, LU Xin, CUI Zhi-gang, KAN Biao, PANG Bo. Establishment of molecular typing database for Vibrio parahaemolyticus[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(11): 920-924.
副溶血弧菌分子分型数据库建立与分析
赵宏群, 刁保卫, 杜小莉, 卢昕, 崔志刚, 阚飙, 逄波     
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 北京 102206
收稿日期: 2015-10-09
基金项目: 国家科技重大专项（No.2012ZX10004215）
作者简介: 赵宏群, 男, 北京市人, 主管技师, 主要从事疾病控制工作; 刁保卫, 女, 北京市人, 副主任技师, 主要从事疾病控制工作
作者贡献: 赵宏群、刁保卫同为第一作者。
通信作者: 逄波, Tel:010-58900744, Email:pangbo@icdc.cn.
摘要: 目的 对我国8个省（直辖市）分离的副溶血弧菌使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）开展分子分型工作进行回顾性分析；建立副溶血弧菌PFGE分型数据库，分析其特征。 方法 对2005-2014年期间分离自8个省（直辖市）的617株副溶血弧菌使用SfiⅠ酶切后进行PFGE实验，使用BioNumerics 5.01软件分析菌株的PFGE图谱并建立副溶血弧菌分子分型数据库。 结果 本研究所建立的副溶血弧菌分子分型数据库共包含617条副溶血弧菌的分子分型信息。这些副溶血弧菌的PFGE图谱可以分为360个PFGE型别，按照PulseNet China的规则对这些PFGE型别进行编码。不同PFGE型别的相似系数介于35.8%~99.6%。237株外环境和食品分离菌株有221个PFGE型别，345株患者分离株有127个PFGE型别。相同血清型的副溶血弧菌具有相同或者非常相似的PFGE型别，而不同血清型之间的副溶血弧菌的PFGE型别差异则较大。大流行血清型（如O3：K6和O4：K8）具有多个优势PFGE型别，对于某些血清型，地理位置相近省份分离菌株的PFGE图谱相似性更高。 结论 分离自患者菌株的PFGE图谱克隆化程度高，而分离自食品和外环境的菌株，PFGE图谱多态性较大。PFGE在发现病例成簇中能够发挥作用；对于患者相关PFGE图谱成簇的菌株应加强流行病学调查和溯源工作。
关键词： 副溶血弧菌     脉冲场凝胶电泳     分子分型数据库     多样性     暴发调查    
Establishment of molecular typing database for Vibrio parahaemolyticus
ZHAO Hong-qun, DIAO Bao-wei, DU Xiao-li, LU Xin, CUI Zhi-gang, KAN Biao, PANG Bo     
Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: pangbo@icdc.cn.
Abstract: Objective To conduct pulse field gel electrophoresis (PFGE) for the Vibrio (V.) parahaemolyticus strains isolated in 8 provinces (municipality) in China and establish a PFGE molecular typing database of V. parahaemolyticus. Methods A total of 617 V. parahaemolyticus strains isolated between 2005 and 2014 were typed by SfiⅠ-digested PFGE. PFGE patterns were analyzed and the database was established with software BioNumerics 5.01. Results The established V. parahaemolyticus molecular typing database included 617 pieces of strain information. All the analyzed V. parahaemolyticus strains were divided into 360 PFGE patterns. The PFGE patterns were encoded according to the regulation of PulseNet China. The similarity index ranged from 35.8% to 99.6%. The 237 strains of V. parahaemolyticus isolated from environment or foods had 221 PFGE patterns, while the 345 strains of V. parahaemolyticus isolated from diarrhea patients had 127 PFGE patterns. V. parahaemolyticus strains with identical serotype had same or similar PFGE patterns, while those with different serotypes had quite different PFGE patterns. Multi predominant PFGE patterns were observed in pandemic serotypes of V. parahaemolyticus i.e. O3:K6 and O4:K8. Conclusion V. parahaemolyticus strains isolated from diarrhea patients showed less diversity than those isolated from foods and environment. PFGE analysis is useful in identifying cases clustering. For diarrhea related V. parahaemolyticus strains, which cluster, intensive epidemiological investigation and source tracking should be carried out.
Key words: Vibrio parahaemolyticus     Pulse field gel electrophoresis     Molecular typing database     Diversity     Outbreak investiyation    

新技术的发展使得病原体研究实验室能够有更多的手段对病原体进行不同层次的分析,以揭示不同病原体之间的关系,从而为传染病暴发的鉴定和追踪提供可靠的可供参考的资料。这些新技术与当前迅猛发展的信息技术相结合,推动了基于网络的病原体实验室监测技术的诞生和发展。目前最可靠也是应用最广泛的是脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)技术体系[1]。以PFGE技术体系为基础,结合其他分型技术以及菌株信息和流行病学信息,我国于2004年建立了国家病原体细菌实验室监测网络——PulseNet China[2]。截至目前,该网络确定了15种病原体的PFGE分型标准方案,其中包括副溶血弧菌。

副溶血弧菌是一种食源性病原菌。在夏秋季节,由副溶血弧菌引起的疾病在我国沿海地区已占据细菌性食物中毒的首位,某些地区副溶血弧菌引起的腹泻占细菌性腹泻的比例最高达67.2%,而且常呈群体性发生[3]。近些年来,由于交通的发展,海产品越来越多的运往内地供人们消费,因此,内地副溶血弧菌感染的比例也呈现上升趋势[4]。由于行政区划的原因,各省或直辖市的疾病控制工作人员只能对各自区域内的副溶血弧菌进行分子分型分析(包括PFGE),获取各自地区内副溶血弧菌的流行情况。但却很难将本区域内的副溶血弧菌的PFGE图谱与更多地区的图谱比较，从而在更加广泛角度研究菌株的多样性。为比较不同地区相同或者相近血清型副溶血弧菌的变异特点以及不同年份相同地区内副溶血弧菌的变异特征,笔者应用标准化的PFGE方案,对20052014年以来的8个省(直辖市)分离的617株副溶血弧菌使用PFGE开展分子分型工作,建立了副溶血弧菌PFGE分型数据库,并进行回顾性分析。

1 材料与方法 1.1 实验菌株

随机选取20052014年分离自我国8个省(直辖市)的副溶血弧菌菌株617株。菌株来源为外环境、食品和腹泻患者(表 1)。所有菌株均经本实验室生化反应鉴定为副溶血弧菌。按照PulseNet China数据库的要求,使用沙门菌Braenderup血清型菌株H9812作为PFGE分子质量标准。

表 1 8个省(直辖市)617株实验菌株来源分布情况 Table 1 Sources of strains used in the study
菌株来源上海北京福建辽宁安徽四川江苏山西总计
患者145986152928240345
环境与食品29159668117110237
来源不明000170001835
合计1741131021004035358617
表选项
1.2 PFGE实验

按照PulseNet副溶血弧菌PFGE标准化方案进行[5]。即用bioMerieux DENSIMAT比浊仪调整细菌悬液浓度(A=3.8～4.0),加入1%的Seakem Gold：1%SDS胶,混匀制备胶块。使用含蛋白酶K的细胞裂解液于55 ℃消化2h。于50 ℃纯水洗涤胶块2次,每次30 min,使用TE(10 mmol/L Tris HCl：1 mmol/L EDTA,pH 8.0)于50 ℃洗涤胶块4次,每次30 min。使用浓度为20 U/μl的SfiⅠ内切酶在37 ℃酶切4 h。使用在CHEF-DRIII电泳仪中进行PFGE。电泳参数为10~35 s,18.5 h。电泳结束后,使用溴化乙锭(EB)染色。在凝胶成像仪中成像,以TIFF图像格式保存结果。

1.3 数据分析

PFGE图像录入BioNumerics (Version 5．01．Appliedmaths,Inc．)软件进行处理,识别图像条带,经统一的分子质量标准进行校准,标定条带位置,必要时进行手工校正,<20.5 kb的条带忽略不计。出现不同条带即判定为不同的型别,对每个型别均进行命名。根据每两个图像之间的相似性系数,用非加权配对算术平均法(unweighted pair group average method，UPGMA)进行聚类,并构建聚类树。

2 结果 2.1 副溶血弧菌PFGE数据的系统命名

使用BioNumerics 5.01软件对得到的TIFF图像进行进一步的数据分析。该TIFF图像经过统一的分子质量标准(沙门菌Braenderup血清型菌株H9812使用XbaⅠ酶切)的校正,形成矫正后的PFGE型别,如果2个或者多个菌株矫正后的PFGE图谱完全相同,则定义为同一个PFGE型别。对于本实验得到的数据,使用PulseNet China统一的型别命名原则进行命名。格式为：K16S12.CNxxxx。其中K16代表副溶血弧菌,S12为内切酶SfiⅠ的代码；CN表示菌株的分离国家为中国,xxxx表示型别编号,通常使用4位数字表示。每次录入新菌株的PFGE型别之后,首先对型别进行命名,同时录入菌株信息。必须录入的菌株信息包括血清型、分离时间、地点和来源。根据此原则,617条副溶血弧菌的PFGE型别编码包K16S12.CN0001~K16S12.CN0360。

2.2 8个省(直辖市)副溶血弧菌分离株PFGE图谱概况

对所挑选的来自8个省(直辖市)617株副溶血弧菌菌株进行SfiⅠ酶切电泳后得到25~1000 kb之间的电泳片段,每个菌株的电泳条带数介于18~24条之间,见图 1。根据100%相似度为同一个PFGE

图 1 617株副溶血弧菌PFGE图谱聚类分析 Figure 1 Cladogram of 617 Vibiro parahaemolyticus based on PFGE analysis
图选项

型别的阈值,617株副溶血弧菌显示了360个PFGE型别,同一带型超过5株菌的带型有16个,同一带型的菌株来自不同时期、不同地点、不同来源,提示副溶血弧菌具有广泛存在的特点。不同型别之间的相似性系数为35.8%~99.6%。在有血清型信息的副溶血弧菌中,优势血清型的前2位分别是O3∶K6和O4∶K8,这两种血清型的菌株数和(PFGE pattern数)分别为44株(17个PFGE pattern)和31株(10个pattern)。

2.3 患者、外环境及食品来源以及来源不明菌株PFGE图谱多态性分析

将617株副溶血弧菌的PFGE图谱按照菌株来源各自进行聚类分析,分离自腹泻患者的345株副溶血弧菌有127个PFGE型别,形成26个聚集簇(≥3株菌株形成聚集簇)；菌株数量排前4位(上海市、北京市、辽宁省、福建省)中,腹泻患者分离株的PFGE图谱型别数目与菌株数目的比值分别为0.41(40/98)、0.83(5/6)、0.53(8/15)和0.46(67/145)。其中,上海市和北京市分离的菌株中,多个年份的腹泻患者来源菌株中均有多个PFGE聚集簇,提示可能存在流行事件,另外,在上海(2009年与2010年)(图 1D)、北京(2010年与2011年)(图 1E)分离的菌株中,观察到同一个PFGE型别跨年度存在的现象。分离自外环境和食品的237株副溶血弧菌有221个PFGE型别,这些菌株未见3株以上的聚集簇(图 1A),菌株排名前4位的4个省(直辖市)中,外环境和食品以及不明来源菌株的PFGE图谱型别数目与菌株数目的比值分别为0.93(14/15)、0.94(90/96)、0.92(79/86)和0.97(28/29)。而35株来源不明的副溶血弧菌可分为12个PFGE型别。

在北京市和上海市的副溶血弧菌的PFGE图谱中,腹泻患者来源的菌株与环境来源的菌株有相同的PFGE型别。此外,从江苏省腹泻患者分离的O4∶K68血清型菌株,其PFGE图谱与相近的上海市腹泻患者分离的部分相同血清型菌株的PFGE图谱完全相同(图 1B)；北京市2011年分离菌株的PFGE图谱与上海市2009年和2010年分离菌株的PFGE图谱相同(图 1D)。相同血清型的副溶血弧菌(如O3∶K6和O4∶K8)的PFGE图谱型别较为相似,其相似度最低为96.2%；而在不同血清型的副溶血弧菌,其PFGE图谱之间的相似性最低为35.8%。

3 讨论

PFGE最初美国用于由细菌引起的食源性疾病暴发的调查中,预警和发现了多起暴发,并在溯源和污染食品召回、避免出现更多病例方面发挥了很大的作用[1]。我国于2004年9月成立了PulseNet China,其目的是提供我国范围内不同地区实验室之间结果比较的平台,以提高我国传染病暴发的发现和预警能力[2]。

副溶血弧菌感染人类通常引起胃肠炎,是一种食源性传染病。在海产品食用量高的地方,特别是温暖的季节(如夏秋季),副溶血弧菌感染引起的胃肠炎发病率尤其高[3]。由于物流和旅行的发达,使得不同地域之间的副溶血弧菌的传播变得更容易发生。对多个地区的副溶血弧菌进行分子分型分析,有可能将不同时间和地点发生的看似无流行病学关联的病例联系起来,从而发现病例成簇现象,有利于暴发事件的鉴定和流行病学追溯。本研究使用PFGE分析观察到多个来自腹泻患者菌株的成簇现象(图 1B、C、D和E),提示存在副溶血弧菌病暴发的可能性,显示出PFGE分析的用途。结果提示应加强对这些菌株的流行病学调查和溯源工作,以便早期发现暴发和传染源,从而控制疾病的传播。同时,通过在PulseNet中心实验室整合不同省级实验室的结果,发现有相同PFGE型别的菌株在相邻行政区域内存在的现象。这种结果是基于各自行政区划的实验室所不能发现的,显示出中心实验室在整合资源中能够提供更多的为疾病控制工作服务的信息。

副溶血弧菌包括多种血清型,在自然水体和海产品中广泛存在。除了引起人类感染的少数几个血清型的菌株外,自然环境中存在大量的不容易从腹泻患者分离到的血清型菌株。在本实验中617株副溶血弧菌的PFGE型别多态性非常丰富,这种现象在外环境和食品来源的菌株中尤其明显,与这些菌株较为广泛的分离时间、地点相关,也与副溶血弧菌在自然水体和海产品中广泛分布有关系。相同血清型的副溶血弧菌具有相同或者非常相似的PFGE型别,不同血清型之间的副溶血弧菌的PFGE型别差异则较大,提示不同血清型的副溶血弧菌具有不同的遗传关系。从所分析的副溶血弧菌的分离地点、分离时间与PFGE型别之间的关系来看,某些PFGE型别连续多年、在多个省市持续存在,提示某些优势型别的传播能力和外界持续存活能力较强；也有可能是某个污染源头持续存在并通过物流或者其他方式向不同地区播散,这些都依赖于进一步的细致分析,并需要加强基于实验室的病原体监测。腹泻患者分离菌株与环境或者食品样品分离菌株有相同的PFGE型别,这种现象在以往报道中并不常见,提示两者之间可能存在直接传播关系,这都将为暴发的调查和传染源的追踪提供有价值的线索。

PFGE数据分析过程中,一个重要的指标是确定同一个PFGE型别的指标,即两个PFGE指纹图谱之间的相似度达到某个相似值才能确定位同一个PFGE型别。在实际操作过程中,可以使用95%~100%的相似度作为同一个型别的判断标准。不绝对使用100%相似性作为判断同一个型别的标准是因为：如果某次暴发时间持续时间较长,那么在疾病的传播过程中,病原体可能会发生变异,从而导致指纹图谱发生相应的改变,这也是Tenover等[6]认为PFGE不适合做分离时间相差太大的菌株之间关系分析的原因之一。本实验使用了最严格的标准——100%的相似性作为同一个PFGE型别判定的标准,因此有可能会漏掉持续时间较长的暴发时间。究竟使用何种相似度作为判断同一个型别的标准,应该结合不同的病原体的变异速率以及流行病学信息来确定。

参考文献
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