耐药结核病尤其是耐多药结核病(MDR-TB)，是目前结核病控制工作中遇到的重大挑战和主要障碍。据世界卫生组织(WHO)估算，2014年全球新发MDR-TB患者约48万例，19万人死于MDR-TB^[1]。全国第五次结核病流行病学抽样调查资料显示，中国每年约有10万例新发MDR-TB患者，其中广泛耐药结核病(XDR-TB)占2.1%^[2]，由此可见中国耐药结核病疫情的严重性，控制耐药结核病是一个迫切需要关注的问题。浙江省每隔5年开展一次结核病耐药监测调查^[3]，温州地区的瑞安市、永嘉县和文成县为随机抽取的耐药监测点。现对该地区3个监测点2008年和2013年耐药监测资料进行分析，以期通过分析结核分枝杆菌(Mtb)耐药状况及特点，为该地区制定正确的技术政策和策略、有效控制耐药结核病疫情提供参考依据。

连续抽取2008年和2013年瑞安市、永嘉县和文成县耐药监测点结核病门诊新发涂阳肺结核患者各30例，并纳入选例期间的复治涂阳肺结核患者，选例不跳选或漏选。新发涂阳肺结核患者是指从未接受过抗结核治疗或抗结核治疗未超过1个月的痰涂片镜检抗酸杆菌阳性(涂阳)肺结核患者；复治涂阳肺结核患者是指复发、治疗失败，抗结核治疗≥1个月的涂阳肺结核患者。纳入病例签订知情同意书。

入选患者留取3份痰标本(即咳痰、晨痰、夜痰)作涂片，采用萋尔-尼尔逊氏(Ziehl-Neelsen)染色法进行染色镜检。各监测点实验室将纳入患者痰标本采用改良罗氏培养基进行培养，每例患者取2份痰标本，培养基由浙江省结防所参比实验室统一提供，培养阳性菌株送到浙江省参比实验室进行菌种鉴定和药敏试验。参比实验室应用比例法进行4种一线抗结核药物异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)和乙胺丁醇(E)敏感性试验，对耐多药(MDR)菌株进行9种二线抗结核药物卡那霉素(KM)、阿米卡星(AM)、卷曲霉素(CPM)、对氨基水杨酸(PAS)、丙硫异烟胺(PTO)、环丝安酸(CS)、氧氟沙星(OFX)、左氧氟沙星(LVFX)和莫西沙星(MOX)敏感性试验。含药培养基药物浓度分别为H 0.2 mg/L，R 40.0 mg/L，S 4.0 mg/L，E 2.0 mg/L，KM 30.0 mg/L，AM 30.0 mg/L，CPM 40.0 mg/L，PAS 1.0 mg/L，PTO 40.0 mg/L，CS 40.0 mg/L，OFX 2.0 mg/L，LVFX 2.0 mg/L，MOX 1.0 mg/L。相关定义:新涂阳耐药：新发涂阳肺结核患者对1种及以上抗结核药物耐药；复治涂阳耐药：复治涂阳肺结核患者对1种及以上抗结核药物耐药；单耐药(MR)：Mtb对1种一线抗结核药物耐药；多耐药(PR)：Mtb对1种以上一线抗结核药物耐药(同时耐H和R除外)；MDR：Mtb至少同时对H和R耐药；广泛耐药(XDR)：Mtb在MDR的基础上至少同时对1种氟喹诺酮类和1种二线注射类抗结核药物耐药。

按照痰涂片镜检室间质量保证要求对痰涂片进行盲法复检质控^[4]。每批培养和药敏试验培养基下发使用前均用结核杆菌标准株(H37Rv敏感株)检测其生长情况，以保障培养基质量。试验中，若高稀释度菌液在对照培养基上生长的菌落数 < 20个菌落，则从对照管传代培养，重复试验。

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计量资料采用中位数、计数资料采用率和构成比描述，率的比较采用χ²检验，当样本量 < 40或期望值 < 1时，采用Fisher确切概率法检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2008年和2013年共纳入病例201例，其中5例因标本污染被剔除，最终获得分枝杆菌分离株196株。Mtb 191株(97.5%，191/196)，非结核分枝杆菌5株(2.6%，5/196)。人型Mtb 180株(94.2%，180/191)，牛型Mtb 11株(5.8%，11/191)。新发涂阳肺结核患者Mtb分离株164株(85.9%，164/191)，复治涂阳肺结核患者27株(14.1%，27/191)。48株Mtb对≥1种药物耐药，总耐药率25.1%(48/191)，其中新涂阳耐药率21.9%(36/164)，复治涂阳耐药率高于前者(44.4%，12/27)，差异有统计学意义(χ²=6.23，P < 0.05)。13株Mtb同时对H和R耐药，总MDR率6.8%(13/191)，其中新涂阳MDR率为4.3%(7/164)，复治涂阳MDR率为22.2%(6/27)，两者差异有统计学意义(χ²=9.12，P < 0.01)。

48株耐药Mtb耐任何抗结核药物的顺位由高到低为S (19.9%，38/191) > H (14.7%，28/191) > R (7.9%，15/191) > E (3.1%，6/191)，新涂阳耐药顺位为S (18.3%，30/164) > H (13.4%，22/164) > R (5.5%，9/164) > E (1.8%，3/164)，复治涂阳耐药顺位为S (29.6%，8/27) > H和R (均为22.2%，6/27) > E (11.1%，3/27)，各药复治涂阳耐药率与新涂阳耐药率比较，S和H差异均无统计学意义(χ²分别为1.87和0.82，均P > 0.05)，R (χ²=6.81，P < 0.01)和E (Fisher确切概率法，P < 0.05)差异均有统计学意义。耐药Mtb对1、2、3和4种药物的总耐药率分别为14.7%(28/191)、5.2%(10/191)、2.6%(5/191)和2.6%(5/191)，其中新涂阳耐药率分别为13.4%(22/164)、4.9%(8/164)、1.8%(3/164)和1.8%(3/164)，复治涂阳耐药率分别为22.2% (6/27)、7.4%(2/27)、7.4%(2/27)和7.4%(2/27)，差异均无统计学意义(均P > 0.05)。PR率3.7% (7/191)，新涂阳PR率(3.7%，6/164)与复治涂阳PR率(3.7%，1/27)相近，差异无统计学意义(Fisher确切概率法，P > 0.05)。MDR菌株对于一线药物S和E耐药率分别为10/13和5/13。48株耐药Mtb构成比中，新患者耐药占75.0%(36/48)，复治耐药占25.0%(12/48)。MR占58.3%(28/48)，新涂阳MR (61.1%，22/36)与复治涂阳MR (6/12)比较，差异无统计学意义(χ²=0.450，P > 0.05)；MR以耐S (57.1%，16/28)和H (35.7%，10/28)为主，共占92.9%；MR中S的新涂阳和复治涂阳耐药率分别为7.3%(12/164)和14.8%(4/27)，差异无统计学意义(χ²=0.86，P > 0.05)。耐2种药占20.8%(10/48)，以耐HS (5/10)为主，耐药率为2.6%(5/191)；其次为耐HR (3/10)，耐药率为1.6%(3/191)。耐3种和4种药各占10.4%(5/48)，耐3种药均为耐HRS，见表 1。

48例耐药肺结核患者中，男36例(75.0%，36/48)，女12例(25.0%，12/48)，性别比3:1；年龄最大83岁，最小22岁，年龄中位数48岁；职业以农民为主，占52.1% (25/48)，其次为家务14.6%(7/48)、民工12.5%(6/48)、工人8.3%(4/48)，经商和其他各2例(4.2%)，教师和干部各1例(2.1%)。13例MDR-TB中，男9例，女4例，性别比2.25:1；年龄最大83岁，最小27岁，年龄中位数51岁；职业分布：农民7例、家务2例，民工、工人、经商和其他各1例。男性与女性的总耐药率和新涂阳耐药率分别为25.5%(36/141)、21.5%(26/121)和24.0%(12/50)、23.3%(10/43)，差异均无统计学意义(χ²分别为0.05和0.06，均P > 0.05)，见表 2。男性与女性的MDR率分别为6.4%(9/141)和8.0%(4/50)，其中新涂阳MDR率分别为4.9%(6/121)和4.7%(2/43)，差异均无统计学意义(χ²分别为0.93和0.00，均P > 0.05)。本次监测纳入病例无15岁以下年龄组患者。总耐药率以45~59岁组最高(31.8%)，新涂阳耐药率以30~44岁组最高(29.5%)，不同年龄组总耐药率和新涂阳耐药率的差异均无统计学意义(χ²分别为5.34和5.62，均P > 0.05)，见表 2。

13株MDR菌株未检出耐KM、AM和PTO菌株，未检出XDR菌株。8株对1种及以上二线抗结核药物耐药，新涂阳MDR二线药物耐药率3/7，复治涂阳为5/6；耐1种二线抗结核药2例(均为耐OFX)，耐2种药4例[分别为耐CS+PAS 2例(均为新发患者)，耐CM+PAS与耐OFX+PAS各1例]，耐3种(CS+OFX+PAS)和4种(CS+OFX+LVFX+MOX，新发患者)二线抗结核药各1例；二线抗结核药物任意耐药频度依次为：OFX和PAS (均为5/13) > CS (4/13) > LVFX和MOX[均为1/4(13株MDR菌株中仅4株检测LVFX与MOX敏感度)] > CM (1/13)，见表 3。

检出非Mtb 5例，检出率2.6%(5/196)，其中新发患者3例，复治患者2例。

20世纪90年代初，全球结核病疫情出现回升，其中耐药结核病的出现是重要原因，特别是MDR-TB排菌时间长、治疗费用高、疗程长、不良反应重、治愈率低、病死率高，严重增加了发展中国家的负担，给结核病的控制带来极大障碍。Mtb耐药监测不仅可以指导临床选择抗结核药物组成有效的治疗方案，更是流行病学的重要指标。据WHO第四次耐药结核病监测报告显示，全球结核病总耐药率为20.0%，MDR率为5.3%^[5]。而我国的Mtb耐药率高于全球水平，总耐药率达36.8%，MDR率6.8%^[2]。本研究中总耐药率25.1%，远低于全国平均水平，亦低于浙江省的总耐药率28.3%^[3]，与吴琳琳等^[6]报道相近，高于李永文等^[7]报道的19.4%和全球平均水平。本研究中温州市MDR率6.8%，略高于上海市(5.3%)和浙江省(5.8%)的MDR率^{[3, 8]}，但明显低于吴琳琳等^[6]报道的10.8%和黄诚等^[9]报道的11.9%。说明温州市结核病防治工作虽然取得一定成效，患者发现和规范化治疗管理不断提高，取得了良好的社会效益和经济效益^[10]，但仍应加强耐药结核病的防控工作，降低耐药率和MDR率。

本研究发现，复治涂阳患者一线抗结核药物耐药率和MDR率都高于新涂阳患者，特别是R，复治涂阳耐药率明显高于新涂阳耐药率。提示对初治失败和复发等耐药高危患者开展药物敏感性试验非常必要，特别要推广线性探针等快速基因诊断方法，要根据药敏结果制订合理、有效的化疗方案。同时还要强调DOTS策略(现代结核病控制策略)仍是结核病控制的基石，是预防耐药结核病发生和传播的最有效手段。

Mtb对一线抗结核药物的耐药频度顺序与山东省耐药监测结果一致^[7]。新发涂阳患者耐药以MR (61.1%)为主，复治涂阳患者MR占50.0%，与李永文等^[7]报道的复治患者的耐药趋向于MDR和PR略有不同；MR以耐S和H为主，共占92.9%，与山东省调查结果相近^[7]。耐药和MDR患者中均以新发涂阳患者占多数(75.0%，53.9%)，再次验证了原发耐药是耐药结核病的重要原因^[11]，可能由于对耐药结核病的传染源控制不足，造成耐药结核菌的传播。今后结核病防控工作除要重视患者发现和治疗管理外，还应该提高对传染期患者实施隔离的重视程度，在早期发现、控制传染源的同时，切断传播途径，从而阻断原发耐药的传播。

本研究中耐药和MDR患者大部分为男性，与该市肺结核患者性别构成一致^[12]。总耐药率和MDR率男性和女性相近，提示性别同Mtb耐药性之间相关性的统计学意义并不显著。总耐药率以45~59岁组最高，可能因为壮年群体活动范围广，生活压力大，抵抗力下降，更容易接触到耐药菌株并被感染。

本研究MDR菌株对于一线药物S耐药率为10/13，与全国耐药基线调查结果相近，对E的耐药率低于全国水平(58.7%)^[13]。8/13 MDR菌株对二线抗结核药物耐药，低于山东省的检测结果(72.6%)^[13]，但高于陈松华等^[14]报道的浙江省MDR-TB二线药物耐药率(51.9%)。耐二线药菌株以耐2种及以上药物为主(75.0%)，与沈鑫等^[15]报道一致。本研究中对OFX的耐药率达到了5/13，与上海地区相近^[16]，而其他2种氟喹诺酮类药物耐药率相对要低，提示在使用氟喹诺酮类药物治疗MDR-TB时，要尽量避免选择OFX。由于本研究中MDR菌株样本量较少，对更大MDR菌株样本的耐药性分析将有助于证实上述推论。

作者贡献:

张淑兰：结果分析、论文撰写、修改

李君：统计学处理

单志力：现场协调

吴晓春：实验室质控

刘松青，缪文明，周海珍：现场数据收集