铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)可引起菌血症、脑膜炎、医院内肺炎、手术后伤口感染和泌尿系统感染等，是院内感染的重要条件致病菌。近几十年来，作为治疗多重耐药革兰阴性菌的碳青霉烯类抗生素的广泛应用，细菌对亚胺培南等耐药率呈逐年上升趋势^[1]。Fass等^[2]报道PA对亚胺培南敏感率从100% 逐年下降到91%，导致PA对碳青霉烯类抗生素耐药的机制有：碳青霉烯酶的产生、AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、外膜孔蛋白缺失和外排泵超表达等，其中因为产金属β-内酰胺酶(MBLs)导致PA对碳青霉烯类抗生素耐药的情况日趋增多^[3]。虽然目前报道产MBLs的PA数量少，但因其整合子的传播特性，随时可能引起PA医院感染的暴发和流行^[4]。辨别耐碳青霉烯酶PA是否同源可以更好的了解细菌的克隆传播情况。在当前的分子分型方法中，脉冲场凝胶电泳(pulse dfield gel electrophoresis，PFGE)以其重复性好,分辨力强而被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”^[5]。本研究收集了大连市4家医院临床分离的400株PA，从中挑出耐亚胺培南菌株检测MBLs基因及采用PFGE进行同源性分析,明确所感染的菌株是否同源，为预防和控制该地区医院感染提供理论依据。

收集2013年1月至2014年9月从大连市第二人民医院(Ⅰ)、大连市友谊医院(Ⅱ)、大连市医科大学附属第一医院(Ⅲ)、大连市医科大学附属第二医院(Ⅳ)四家医院临床标本中分离到的400株PA菌株。

采用哥伦比亚琼脂和相关鉴定卡(VITEK-AMS)进行菌株鉴定。K-B法对11种临床常见药物进行药敏试验，按美国临床实验室标准化协会(2012版CLSI)标准操作，以标准菌株进行鉴定及药敏质控，判读药敏结果。其中亚胺培南和美洛培南的判断折点为：最低抑菌浓度(MICs)≤ 4 μg/ml为敏感，MICs=8 μg/ml为中介，MICs≥ 16 μg/ml为耐药。对亚胺培南耐药的菌株按照除亚胺培南外10种抗生素耐药/敏感结果进行分型，凡是对10种抗生素敏感性结果完全一致的归为相应的耐药模式中，按照耐药严重程度，对以上10种抗生素均耐药的模式称为a型，依次排b、c、d、……型等。

引物设计：参考国内外现有的文献报道^[6-7]，设计检测MBLs编码基因的聚合酶链反应(PCR)引物和反应条件，进行PCR扩增。引物序列由大连宝生物公司合成，见表 1。

随机抽取每种PCR扩增阳性的产物2个，将纯化与回收后的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司测序。

对耐亚胺培南PA进行PFGE试验，使用SpeⅠ内切酶37 ℃酶切2 h。电泳参数：6 V/cm，17.5 h，初始转换时间0.47 s，终末转换时间63 s，角度120°。所获取的图谱用BioNumerics software 4.61软件进行聚类分析，选择UPGMA方法并制成树状图。条带位置差异容许度(PT)选择1.7% ，优化值选择0.5% ，相关研究在解释PFGE 结果时提出将具有85%以上相同条带的菌株认为是相同的菌株^[8-9],本研究凡相似度值>85%者为同一亚型，代表同一克隆株。

400株PA中有89株对碳青霉烯类药物亚胺培南耐药，耐药率为22.25%(89/400)。按耐药/敏感结果进行分型将89株耐亚胺培南菌株划分为21种耐药模式，分别描述为a、b、c、……t、u型，见表 2。89株耐亚胺培南PA耐药情况严重，对11种临床常用药物中的10种药物的耐药率均在50%以上，其中有76株菌株为多重耐药菌株，对11种抗生素耐药的a型有16株，此外有23株b型对除哌拉西林外的上述5类11种临床常用药物耐药，c～n型共37株也对碳青霉烯类(美洛培南、亚胺培南)、氨基糖苷类(庆大霉素、阿米卡星、哌拉西林)、头孢类(头孢他啶、头孢噻肟)、氟喹诺酮类(环丙沙星、左氧氟沙星)、含酶抑制剂的β-内酰胺类抗菌药物(氨曲南)中的3类或者3类以上耐药。

经PCR扩增89株亚胺培南耐药PA，MBLs阳性的有11株，其中8株为IMP-1，3株为VIM-2，其他几种基因(IMP-2、VIM-1、SPM、GIM、SIM和NDM)均未检出。IMP-1和VIM-2引物扩增阳性的菌株测序结果在http：//www.lahey.org/studies/网站查询，分别与IMP-1注册号AY168635和VIM-2注册号AY029772相同。IMP-1型菌株分别来自上述4家医院，VIM-2型菌株来自大连市医科大学附属第一医院和大连市医科大学附属第二医院。IMP-1、VIM-2电泳结果见图 1、2。

图 1 IMP-1扩增产物电泳结果 Figure 1 Electrophoresis results of IMP-1 a mplification products 注：1：DNA Ladder； 2~9：IMP-1阳性扩增产物； 10：IMP-1阴性对照； 11：IMP-l阳性对照。

图选项

图 2 VIM-2扩增产物电泳结果 Figure 2 Electrophoresis results of VIM-2 amplification products 注：1：DNA分子标记； 2~4：VIM-2阳性扩增产物； 5：VIM-2阴性对照； 6：VIM-2阳性对照。

图选项

将89株耐亚胺培南PA的PFGE图谱按照条带位置差异85%相似度分成15个亚型(A~O)，其中A型46株、B型16株、C型4株、D型5株、E型4株、F型3株、G型2株、H型2株，I~O型分别各有1株。条带亚型集中的A~H型各型中的菌株来源于4家不同医院，每种亚型均存在条带100%相似的克隆株：其中A型中有三大组条带100%带型一致：菌株数分别有10、14和21株，B型中16株、C型4株、D型3株、E型4株、F型3株、G型2株、H型2株为克隆传播。8株金属酶基因IMP-1型阳性菌株分布在PFGE图谱的不同亚型条带：A型3株、B型3株、D和I型各1株；VIM-2型阳性菌株分布在C型1株、G型2株，而C型和G型之间条带相关性为82%。见图 4。

图 3 89株耐亚胺培南PA的PFGE树状图 Figure 3 PFGE dendrograms of 89 imipenem-resistant P. aeruginosa strains 注：□为MBLs基因IMP-1型阳性菌株，为VIM-2型阳性菌株。

图选项

本研究药敏结果可知89株耐亚胺培南PA的耐药情况严重，对11种临床常用药物中的10种药物的耐药率均在50%以上。重要的是耐亚胺培南的PA大多是多重耐药菌株，耐药水平高；据报道发现PA可以获得多种β-内酰胺酶基因^[10]，特别是MBLs基因^[11-12]，是PA耐碳青霉烯类药物的主要β-内酰胺酶基因。目前，MBLs至少有9种^[13]基因型。本研究针对亚胺培南耐药组经PCR扩增MBLs基因阳性的有11株，阳性率为12.4%(11/89)，其中8株为IMP-1，3株为VIM-2，其他几种MBLs基因均未检出，与相关报道基本一致^[14]。本研究显示，PA产MBLs基因型有差异，耐药性也有不同。8株IMP-1型菌株中，3株对所测抗菌药物全部耐药，有4株的耐药模式为b、c，只对1种抗菌药物敏感，3株VIM-2型菌株全部对所测抗菌药物耐药，结果提示大连市需对产MBLs PA进行长期监测及分析，以防此类碳青霉烯类抗生素耐药革兰阴性杆菌的快速蔓延。

现代分子分型技术能够追溯感染源，分辨不同的感染病例是否为同一克隆所致，是证实感染疫情暴发流行的可靠方法^[15]。但现在医院对于细菌的流行病学分型仍然依靠细菌表型耐药模式，实际结果并不准确。从本研究可看到，89株耐碳青霉烯PA根据10种抗菌药物药敏结果划为21种耐药模式，其中PFGE的A型克隆株表现出18种耐药模式；同样，a型耐药模式分属在6型克隆中。说明细菌的表型耐药特征和基因型之间并无明确相关性，同一种耐药模式可表现为不同的基因型，不同耐药模式可有相同的基因型。可见通过耐药模式对细菌进行流行病学分型的方法并不可靠。当临床的检测中，如发现同一时期大多数菌株出现同一耐药模式，特别是多重耐药菌株，应高度警惕是否有相同克隆来源的细菌存在，进行分子流行病学的调查，以便及早发现细菌暴发流行或克隆传播的可能性。

对细菌进行基因水平分型是流行病学研究的重要工具，PFGE方法具有特异性、稳定性、易于观察结果和良好的分辨率等特点，目前已在国际上广泛应用^[16]。本研究PFGE结果显示89株耐亚胺培南PA中检测出15个染色体亚型，A亚型在4所医院中都是主要型别(表 2)，是大连地区耐亚胺培南PA优势型别。15个染色体亚型平均分布在本次研究的4所医院，推测耐碳青霉烯PA多重耐药株在大连各医院间有相互传播的可能性。其中A～H型在每个医院中都存在基因带型100%相似的克隆株，说明同一克隆菌株在院内播散。因此应加强相关患者的隔离，病房以及相关器械的消毒，阻断外源性传播媒介，避免PA院内感染。

8株产IMP-1型PA存在于多个PFGE亚型中，分散在4所医院，每个医院都存在PFGE带型100%一致的菌株，存在散发性暴发流行的可能，需加强监测。3株产VIM-2型PA有2株PFGE条带100%相同，菌株来自一所医院的重症监护(ICU)病房，提示该ICU病房需实施隔离、消毒以达到早期控制的目的。

建议规范抗菌药物的应用，加强对PA的耐药性监测，及时进行菌株药敏试验和基因同源性分析，采取预防为主的策略，避免大量和长期使用同一类型的抗菌药物，从而更好地预防和控制医院感染。