2017, Vol. 32扩展功能
文章信息
- 狄春红, 谭晓华, 王小波, 赵婷婷, 刘宇超, 洪玉, 许亮文, 杨磊
- DI Chun-hong, TAN Xiao-hua, WANG Xiao-bo, ZHAO Ting-ting, LIU Yu-chao, HONG Yu, XU Liang-wen, YANG Lei
- KCNJ1基因多态性与浙江省宁波地区汉族人群血脂水平相关性分析
- Correlation between KCNJ1 gene polymorphism and blood lipid level in Han ethnic group in Ningbo, Zhejiang
- 疾病监测, 2017, 32(1): 52-56
- Disease Surveillance, 2017, 32(1): 52-56
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.01.014
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文章历史
- 收稿日期：2016-06-01
2. 杭州师范大学医学院, 浙江 杭州 310036
2. Medical School of Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, Zhejiang, China
血脂是血浆中的脂质类物质，包括甘油三酯(triglyceride，TG)、磷脂(phospholipid，PL)、胆固醇(cholesterol，C)、胆固醇酯(cholesterol ester，CE)和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)等。血脂紊乱是冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中等多种心血管疾病重要危险因素。血脂水平受环境因素、生活行为方式及遗传等多种因素的调节。已有的研究发现了近百个与血脂相关的基因，这些基因多与血脂代谢相关[1]，此外，近年的全基因组关联研究(genome wide association study，GWAS)发现了一些与血脂代谢没有直接关系的基因与血脂水平相关[2-4]。内向整流性钾离子通道(inwardly-rectifying K+ channels,Kir)是指一类组织中广泛分布的钾离子通道，其对K+的内流通透程度大于K+的外流通透程度，故称为内向整流。该特点使其在保持细胞正常兴奋性和保持血钾平衡方面具有重要的生理学意义，Kir基因与血压密切相关[5-6]。目前发现的Kir家族可分为7种类型，每类又可再分为多种亚型。钾内向整流通道超家族J成员1(potassium inwardly-rectifying channel，subfamily J，member 1，KCNJ1)基因定位于11号染色体长臂2区4带(11q24)，编码的蛋白是一种完整的膜蛋白和内向整流型钾通道。最近研究报道了位于11号染色体短臂1区5带5亚带(11p15.5)的Kir家族的另一成员KCNQ1基因的多态性与汉族人群血脂水平相关[7]。结果提示该基因家族的其他成员也可能与血脂水平相关，本研究检测了KCNJ1基因上rs675759、rs675388、rs2846679 位点基因型的分布，分析这些位点基因多态性与血脂水平的相关性。
1 对象与方法 1.1 研究对象以浙江省宁波市鄞州区作为研究现场，于2013年47月间，采用整群随机抽样的方法，抽取该区下属的4个乡镇(横街、高桥、古林和集仕港)作为调查点。选取年龄≥40岁的汉族常住居民2 330例作为研究对象。本文中常住居民是指在本地居住10年以上的居民。排除医院明确诊断患有高血压、心脑血管疾病、糖尿病、肾脏疾病者，以及未被医院明确诊断患有上述疾病，但近6个月内服用降血压或血脂药物者。
1.2 流行病学调查调查前编制统一的调查问卷及填表说明，经专家修订完善后使用，按照填表说明对所有调查员进行统一培训。调查采用面对面访谈的方法，主要内容：一般人口学资料(包括姓名、性别、年龄、文化程度、职业等)、生活行为方式(吸烟、饮酒、饮食习惯、体力活动情况等)、体格检查(包括身高、体重、腰围等)和血压。
1.3 标本采集及处理所有调查对象均要求晨起空腹、当天不服用任何降压药和降脂药，由护士采集其外周静脉血液样本，包括EDTA抗凝全血5 ml和非抗凝全血5 ml。非抗凝全血3 000 r/min离心10 min，分离血浆备用。所有血液样本管壁和调查问卷贴相同的流水码。所有血液样本均于-80 ℃冰箱中冷冻保存，由研究现场送至实验室进行生化检测及基因分型检测，运输过程保证全程冷链运输，且避免剧烈震动而导致溶血。
测定的血脂指标包括：总胆固醇(total cholesterol，TC)、TG、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。
1.4 基因组DNA提取取5 ml静脉血置于 EDTA-K2 抗凝管中保存，于- 70 ℃超低温冰箱中以备提取 DNA。用酚氯仿法提取外周血白细胞DNA；用分光光度法测定DNA浓度，并稀释DNA浓度至10～30 ng/μl，用作PCR扩增模板。
1.5 基因分型采用聚合酶链反应-连接酶检测技术(polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR)进行基因位点分型检测。主要仪器试剂：Taq酶、dNTP为Fermentas公司产品，Taq DNA 连接酶为NEB公司产品。PCR仪型号为东胜龙(EDC-810)，测序仪型号为ABI 3730XL。首先使用PCR扩增含有突变位点的基因片段，扩增条件为94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。然后采用3 条根据该单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点设计的探针来分辨该位点的基因型，连接反应条件为4 ℃ 30 s，56 ℃ 3 min，30个循环。其中2 条探针与SNP 位点上游序列完全互补但长度不同，且3′端碱基根据基因型有所不同；另一探针(FAM荧光标记)与SNP下游序列互补。根据连接酶的特性，不同基因型得到的连接片段长度不同[8]。采用Genemapper 4.0软件分析连接片段的数据，得出不同的基因型。各位点基因分型的引物和探针序列见表 1。
| SNPs | 引物 | 探 针 |
| rs675759 | F：CTA AAA GGG ACC AGC TTA TGG | R：TGC TTA GGA ATC AAA ATG TTT TCA GTT TTT T-FAM |
| R：GGA ACC TGA CTC AGT TAA TGC | C：TTT TTT TTC TGG AAA AAA ACT GGT ACT CAA AGC | |
| G：TTT TTT TTT TTC TGG AAA AAA ACT GGT ACT CAA AGG | ||
| rs675388 | F：CTA AAA GGG ACC AGC TTA TGG | R：GAA TGT GTC CTG GAA AAA AAC TGG TAC TCT TTT TTT T-FAM |
| R：GGA ACC TGA CTC AGT TAA TGC | C：TTT TTT TTT TTT TTT TTT CAG ATC CCC ACC TGC ATC ATT CC | |
| T：TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT CAG ATC CCC ACC TGC ATC ATT CT | ||
| rs2846679 | F：CCC AGA AGA TGA GTG AAT TCC | R：GAA GGT CTG GGG GAA AGG CTG GCC CTT TTT TTT T-FAM |
| R：ACT TCC CTG GGT CTT GAG AAG | G：TTT TTT TTT TTT TTT GTC TAA GGC AGG AGG GAA AAG GAA G | |
| A：TTT TTT TTT TTT GTC TAA GGC AGG AGG GAA AAG GAA A |
采用EpiData 3.0软件建立数据库，SPSS 17.0软件包分析数据。TC、LDL-C、HDL-C数据呈正态分布，用均数±标准差(x±s)表示，TG数据呈偏态分布，用中位数表示。TG 数据经对数转化后符合正态分布。Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinberg，HWE)检验判断样本是否达到遗传平衡状态。将每个SNP位点的小等位基因纯合型用R/R表示,杂合型用C/R表示，大等位基因的纯合型用C/C表示。将C/C、C/R、R/R分别赋值为0、1、2。以年龄、性别、体质指数(body mass index，BMI)、血压等作为校正因素，采用多重线性回归法分析基因型对4项血脂指标是否有影响。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 研究人群基本情况和SNP分型信息共2 330人完成问卷调查、血脂和基因分型检测，其中男性1 073例，女性1 257例。样本人群的年龄、性别、BMI、血脂水平等基本信息见表 2。3个位点分型成功率均＞99%，HWE检验结果显示均P＞0.05，说明本研究样本已经达到遗传平衡状态；最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)均＞0.1，每一基因型均有较多的病例数，保证数据分析有较好的统计效能。各位点的基因型分布、MAF及HWE检验信息见表 3。
| 项目 | 男性 | 女性 | 合计 |
| 人数 | 1 073 | 1 257 | 2 330 |
| 年龄(岁) | 60.36±11.59 | 58.32±11.05 | 59.26±11.35 |
| BMI(kg/m2) | 23.08±2.90 | 23.39±3.13 | 23.24±3.02 |
| TC(mmol/L) | 4.78±0.89 | 4.98±0.93 | 4.89±0.92 |
| TG(mmol/L) | 1.19(0.92～1.66) | 1.34(0.85～1.87) | 1.28(0.96～1.78) |
| HDL-C(mmol/L) | 1.29±0.34 | 1.29±0.28 | 1.29±0.31 |
| LDL-C(mmol/L) | 2.98±0.78 | 3.07±0.64 | 3.06±0.81 |
| 位点 | 基因分型
成功率(%) | 基因型 | 样本数 | 百分比
(%) | 最小等位
基因频率 | Hardy-Weinberg平衡检验 | |
| χ2值 | P值 | ||||||
| rs675759 | 99.70 | CC | 1 773 | 76.30 | 0.126 | 0.120 | 0.73 |
| CG | 515 | 22.20 | |||||
| GG | 35 | 1.50 | |||||
| rs675388 | 99.60 | CC | 1 811 | 78.00 | 0.117 | 0.005 | 0.94 |
| CT | 478 | 20.60 | |||||
| TT | 32 | 1.40 | |||||
| rs2846679 | 99.40 | GG | 1 835 | 79.30 | 0.109 | 0.860 | 0.35 |
| GA | 457 | 19.70 | |||||
| AA | 23 | 1.00 | |||||
以年龄、性别、BMI和血压等作为校正因素，采用多重线性回归法分析基因型对4项血脂指标的影响。rs675388和rs2846679位点对TC水平有显著影响，rs675388位点每个T等位基因使TC水平增加0.14 mmol/L，rs2846679位点每个A等位基因使TC降低0.09 mmol/L。rs675759和rs675388与HDL-C水平显著相关，rs675759位点每个G等位基因使HDL减少0.12 mmol/L，rs675388位点每个T等位基因使HDL-C增加0.12 mmol/L。rs2846679位点与TG水平相关，每个A等位基因使TG下降0.08 mmol/L。各位点不同基因型间LDL-C水平差异均无统计学意义。各位点不同基因型血脂水平及基因多态性与血脂水平的相关性分析见表 4。
| SNP | C/C(1) | C/R(1) | R/R(1) | 效应(95%CI)(2) | P值 |
| TC | |||||
| rs675759 | 4.89±0.92 | 4.88±0.93 | 4.90±0.98 | -0.04(-0.29～0.14) | 0.50 |
| rs675388 | 4.88±0.92 | 4.91±0.92 | 4.91±1.04 | 0.14(0.07～0.48) | 0.01 |
| rs2846679 | 4.90±0.93 | 4.84±0.91 | 4.89±0.92 | -0.09(-0.35～-0.04) | 0.01 |
| HDL-C | |||||
| rs675759 | 1.30±0.30 | 1.30±0.33 | 1.26±0.26 | -0.12(-0.15～-0.01) | 0.03 |
| rs675388 | 1.29±0.30 | 1.31±0.33 | 1.28±0.29 | 0.12(0.01～0.15) | 0.03 |
| rs2846679 | 1.29±0.31 | 1.31±0.33 | 1.25±0.30 | 0.02(-0.04～0.07) | 0.55 |
| LDL-C | |||||
| rs675759 | 3.06±0.81 | 3.07±0.82 | 2.99±0.86 | 0.02(-0.16～0.22) | 0.74 |
| rs675388 | 3.06±0.81 | 3.08±0.83 | 2.96±0.90 | 0.05(-0.10～0.26) | 0.39 |
| rs2846679 | 3.07±0.81 | 3.06±0.83 | 2.72±0.73 | -0.06(-0.25～0.02) | 0.10 |
| TG | |||||
| rs675759 | 1.28(0.96～1.77) | 1.36(0.93～1.83) | 1.29(1.09～1.83) | 0.03(-0.16～0.26) | 0.64 |
| rs675388 | 1.28(1.05～1.76) | 1.29(0.92～1.83) | 1.28(0.96～1.77) | 0.03(-0.15～0.25) | 0.63 |
| rs2846679 | 1.29(0.96～1.79) | 1.24(0.92～1.76) | 1.28(0.99～1.69) | -0.08(-0.07～-0.02) | 0.04 |
| 注： (1)R/R为小等位基因纯合型；C/R为杂合型；C/C为大等位基因的纯合型； (2)采用加性模型计算每一小等位基因替代1个大等位基因后对血脂水平的影响，单位为mmol/L。 | |||||
本研究分析了KCNJ1基因上3个位点rs675759、rs675388、rs2846679不同基因型对各项血脂指标水平的影响。KCNJ1基因定位于11号染色体长臂2区4带(11q24)，编码的蛋白是一种完整的膜蛋白和Kir，通道由内部的ATP激活，发挥调节钾平衡的重要作用，具有促进钾离子进入细胞的功能。KCNJ1基因为Kir蛋白基因的一种，其转录表达的蛋白控制钾离子通道进出细胞。在西方人群中研究发现与KCNJ1基因十分相近的钾离子通道蛋白KCNQ1基因与2型糖尿病发病有一定的联系[9-10]。国内研究表明KCNQ1基因的多态性与血脂水平和血脂异常有一定的相关性[7]。但对KCNJ1基因多态性的影响与血脂水平的影响尚未见报道，推测KCNJ1也可能与血脂水平和血脂异常有相关性。本研究共采集中国汉族人群样本2 330例，采用PCR-LDR技术对rs675759、rs675388、rs2846679基因位点进行基因分型检测，多重线性回归方法分析不同基因型与血脂水平的相关性。
在校正了可能影响血脂水平的年龄、性别、腰围、BMI等因素后，多重线性回归显示，各位点基因型与血脂水平相关。dbSNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)显示rs675759位点MAF=0.164，但在本研究人群中G等位基因频率为0.126。目前，尚未见到中国汉族人群该位点基因型分布的报道。TC水平增加是高脂血症及心脑血管疾病的危险因素，rs675759位点每个G等位基因使HDL-C减少0.12 mmol/L，提示G等位基因可能是宁波地区汉族人群血脂异常和心脑疾病的发病风险。本研究人群rs675388 位点T等位基因频率为0.117，该位点每T等位基因使TC水平增加0.14 mmol/L，HDL-C增加0.12 mmol/L。综合来看，rs675759和rs675388均使胆固醇水平增加。有意思的是KCNJ1的另一个rs2846679位点每个A等位基因使TC降低0.09 mmol/L，TG下降0.08 mmol/L，本结果提示该位点的小等位基因A对血脂异常和心脑血管病具有保护作用。Tobin等[11]发现在英国人群中，rs675759及rs2846679位点均与血压水平相关，与血脂相关性研究未见报道。Tobin等[11]发现在英国人群中rs675759、rs675388及rs2846679位点的MAF值分别为0.15、0.15和0.16，本研究结果为0.126、0.117和0.109。国内尚无几个位点基因型分布的研究报道，宁波地区汉族人群的结果提示这些位点在中国人群中可能有更低的分布频率。KCNJ1基因多态性与中国汉族血脂、血压水平的相关性及影响血脂水平的机制需要进一步研究。
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