自2008年3月安徽等地报道手足口病以来，由肠道病毒71型 (Enterovirus 71，EV71) 和柯萨奇病毒A组16型 (Coxsackievirus A16，Cox A16) 引起的手足口病在我国一直流行。近年来，手足口病在我国的发病率和病死率呈上升趋势，可能与病毒变异或重组、易感人群累积和遗传敏感性有关，已经严重威胁到患者的生命健康^[1-2]。手足口病是儿童常见的急性肠道传染病，由人肠道病毒引起，属于小核糖核酸病毒科、肠病毒属，多发生于5岁以下婴幼儿童。引起手足口病的肠道病毒有20多种，其中，最常见的为EV71和Cox A16^[3]。EV71引起手足口病可诱发严重并发症，其发生比例与其他病毒相比，不仅发生率高且病情严重。相对于EV71，Cox A16引起的手足口病症状较轻，且很少有并发症发生。EV71与Cox A16在遗传上有一定的相似性，二者联合感染流行常会导致比较严重的手足口病疫情^[4]。

本研究根据2014-2015年湖北省手足口病病原学监测结果，对EV71和Cox A16进行VP1基因序列测定和遗传进化特征分析，探明EV71和Cox A16在湖北省的主要型别以及分子流行病学特点，为疫情的预防控制提供科学的理论依据。

标本为2014-2015年湖北省手足口病病原学监测上送省级实验室的肛拭子、咽拭子或疱疹液。样本来自于黄石市、鄂州市、宜昌市、咸宁市、荆门市、荆州市、潜江市和神农架林区。采用实时荧光定量聚合酶链反应 (quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 对部分地区212份疑似手足口病标本进行EV17和Cox A16核酸检测，分别检出51份EV71和32份Cox A16阳性标本。

采用Viral RNA Mini Extraction Kit (Qiagen) 对手足口病标本进行核酸提取，具体操作步骤参考试剂盒说明书进行，提取核酸于-70 ℃暂存，并及时检测。

采用ABI7500荧光定量PCR仪器进行检测，EV71和CoxA16手足口病病毒检测试剂盒购自江苏硕世生物科技有限公司。根据试剂盒说明书检测进行，qRT-PCR扩展曲线呈典型“S”形扩增曲线且Ct值≤38，则判样本为阳性。

对EV71和Cox A16核酸qRT-PCR检测阳性的样本进行VP1基因扩增，根据文献对EV71和Cox A16的VP1基因引物进行扩增^[5]。PCR和基因测序使用one-step RT-PCR法 (TaKaRa公司) 进行VP1基因扩增。扩增条件：94 ℃变性3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃，7 min。PCR产物直接测序，基因测序在生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

所获序列与NCBI中EV71与Cox A16的VP1基因序列比对。采用DNA Star Meg Align 5.0与Mega 5.0软件构建进化树和序列同源性分析。

本研究中EV71、Cox A16序列GenBank收录号分别为KY100879-904、KY100905-931。

使用EV71和Cox A16的VP1基因引物进行PCR扩增，PCR产物大小分别约为1 200 bp和1 100 bp，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序。

将来自湖北省2014-2015年26株EV71流行株与来自NCBI中的EV71病毒株进行氨基酸与核苷酸序列同源性比对。EV71病毒株的氨基酸与核苷酸序列同源性分别为97.6%~100.0%和92.3%~100.0%，与我国其他地区EV71病毒株的核苷酸和氨基酸序列具有较高同源性，见表 1。

对湖北省2014-2015年26株Cox A16的流行株进行VP1基因核苷酸序列测定和分析。发现湖北Cox A16病毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性分别为92.3%~100.0%和96.6%~100.0%；与A基因型代表株Cox A16 G-10核苷酸和氨基酸同源性分别为75.3 %~77.2%和89.6%~92.3%；与B基因型各亚型同源性比较见表 2。

根据EV71全长VP1基因核苷酸序列，以Cox A16 G-10为外类群，对2014-2015年湖北省EV71流行株的VP1进行进化分析，见图 1。发现EV71与我国其他地区流行EV71均位于一个大的分支上，均为C4基因型的C4a亚型。

图 1 EV71的VP1进化分析 Figure 1 Phylogenetic tree of EV71 in VP1 genes 注：●代表湖北省EV71流行株。

图选项

以EV71-BrCr株为外类群，对2014-2015年湖北省Cox A16流行株的VP1进行进化分析，发现2014-2015年流行的Cox A16病毒株位于同一分支上，主要为B1b亚型，见图 2。系统发育分析显示，湖北省省内流行的EV71和Cox A16，在进化树上聚类在一个分支，本研究中阳性标本来自于省内不同地区，说明2014-2015年间省内流行的毒株在遗传进化上无较大差异，具有较近的亲缘关系，但未发现B1a亚型的Cox A16的流行。

图 2 Cox A16的VP1区进化分析 Figure 2 Phylogenetic tree of Cox A16 in VP1 genes 注：●湖北省EV71流行株。

图选项

引起手足口病的肠道病毒有20多种，以EV71和Cox A16最为普遍，而EV71危害较重^[6-7]，严重者可以引起死亡。VP1基因是EV71分子流行病学研究的主要内容之一，VP1基因不仅是病毒主要抗原性基因，其编码的蛋白也是病毒中和决定因子，并且与病毒血清型完全对应^[8]，也是肠道病毒血清型的分型依据^[3]。因此，对EV71和Cox A16的VP1区的分子进化研究，能够全面了解湖北省EV71和Cox A16的流行规律，以便指导湖北省手足口病疫情预防和控制。

本研究通过对2014-2015年湖北省部分地区Cox A16与EV71流行株进行VP1基因序列扩增、测序、同源性比对与遗传进化分析，发现湖北省EV71均为C4a基因亚型，与我国其他地区的EV71同源性较高，EV71进化分析与湖北省既往研究相似^[5]，省内各地区间无较大差异。遗传进化分析显示湖北省EV71与我国其他地区近年EV71具有相同的进化来源。2014-2015年湖北省EV71流行株与我国2013年和2014年的EV71毒株在一个分支上，与2008年和2009年等早年的EV71不同，说明湖北省流行的EV71在不断进化。

湖北省Cox A16病毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性分别为92.3%~100.0%和96.6%~100.0%；与A基因型代表株Cox A16 G-10和B1a、B1b、B1c和B2各亚型VP1区核苷酸同源性有一定差异，但是氨基酸同源性较高，可能存在一定程度的同义突变。目前Zhang等^[7]将中国Cox A16病毒株分为A、B基因型，并根据核苷酸差异和进化特征又将B基因型分为B1、B2两个亚型，B1亚型又分为B1a、B1b和B1c三个亚型别，B1c和B1a、B1c和B1b之间的核苷酸差异分别为7.0%和6.8%；B1a和B1b之间的核苷酸差异为6.5%。2014-2015年湖北省部分Cox A16病毒株进化分析发现主要为B基因型的B1b基因亚型；而2012-2013年间湖北省的Cox A16的基因型主要为B1b，也发现少量B1a基因亚型^{[7, 9]}，近年来Cox A16以B1b为优势流行的基因亚型，而曾在2013年出现的Cox A16的B1a亚型未发现^[10]；表明湖北省Cox A16的基因型别流行是不断变化的。

从进化树中可以看到2014-2015年的Cox A16病毒株形成不同的分支，大部分Cox A16病毒株与来自于2013年北京市和2014年广东省的Cox A16位于同一个分支上，具有较近的亲缘关系，也有部分Cox A16病毒株分别与2009年和2010年的我国其他地区的Cox A16病毒株具有较近的亲缘关系，说明虽然2014-2015年Cox A16流行的基因型别主要为B1b，但流行的Cox A16病毒株的起源不同，增加了对Cox A16流行防控的复杂性和艰难性。

作者贡献:

占建波  ORCID：0000-0002-5885-1970

占建波：项目设计、监测数据统计分析

李静：负责基因测序、病原检测

杨朝晖：参与病毒分离等工作

詹发先：提出论文修改意见、审核论文