疾病监测  2017, Vol. 32 Issue (2): 102-105

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陈士伟, 王洁, 周仁希, 周俊, 陈东, 吴亦栋
CHEN Shi-wei, WANG Jie, ZHOU Ren-xi, ZHOU Jun, CHEN Dong, WU Yi-dong
2015年杭州市手足口病肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型构成变化与联合检测方法分析
Changes in pathogen constituent of EV71 and Cox A16 and combined detection methods of hand foot and mouth disease in Hangzhou, 2015
疾病监测, 2017, 32(2): 102-105
Disease Surveillance, 2017, 32(2): 102-105
10.3784/j.issn.1003-9961.2017.02.006

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收稿日期：2016-04-28
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陈士伟, 王洁, 周仁希, 周俊, 陈东, 吴亦栋. 2015年杭州市手足口病肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型构成变化与联合检测方法分析[J]. 疾病监测, 2017, 32(2): 102-105.
CHEN Shi-wei, WANG Jie, ZHOU Ren-xi, ZHOU Jun, CHEN Dong, WU Yi-dong. Changes in pathogen constituent of EV71 and Cox A16 and combined detection methods of hand foot and mouth disease in Hangzhou, 2015[J]. Disease Surveillance, 2017, 32(2): 102-105.
2015年杭州市手足口病肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型构成变化与联合检测方法分析
陈士伟, 王洁, 周仁希, 周俊, 陈东, 吴亦栋     
杭州市儿童医院, 浙江 杭州 310014
收稿日期: 2016-04-28
基金项目: 浙江省自然科学基金（No.LY13H040007）；浙江省医药卫生科技计划项目（No.2014KYA186）；杭州市发展计划项目（No.20130733Q40）
作者简介: 陈士伟, 女, 江苏省宝应县人, 主管技师, 硕士, 主要从事临床检验工作
通信作者: 吴亦栋, Tel:0571-85463938, Email:wyd721@sina.com.
摘要: 目的 采用肠道病毒核酸和抗体检测，分析2015年杭州市手足口病肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）构成变化及检测方法学评价。 方法 收集2015年4-8月手足口病患儿663例，采用荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肠道病毒核酸，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清EV71-IgM、Cox A16-IgM。 结果 663例手足口病患儿通用核酸阳性组58.52%（388/663），EV71组19.16%（127/663），与2014年比较，通用核酸阳性组比例（χ2=166.306，P=0.000），EV71组比例（χ2=134.418，P=0.000）差异有统计学意义。手足口病患儿轻症487例，占73.45%，以通用核酸阳性组65.91%（321/487）为主；重症176例，占26.55%，EV71组43.75%（77/176）、通用核酸阳性组38.07%（67/176）位居前2位。不同组别出现重症的比例（χ2=98.395，P=0.000）差异有统计学意义，EV71出现重症比例最高，为60.63%（77/127）。病毒核酸检测和血清抗体检测阳性率比较差异有统计学意义（χ2=44.487，P=0.000）。其中，127例EV71阳性患儿，核酸和抗体检测双阳性率为59.85%（76/127），单阳性率为40.15%（51/127）；64例Cox A16阳性患儿，核酸和抗体检测双阳性率为9.38%（6/64）；单阳性率为90.62%（58/64）。以核酸定量RT-PCR为标准，EV71/Cox A16-IgM抗体特异度86.61%, 敏感度69.49%。 结论 2015年与2014年比较，杭州市手足口病病原学流行特征有明显变化。采用病毒核酸和抗体联合检测，可提高实验室的检测阳性率，临床分型有助于辅助指导临床治疗；通用型重症病例增多，需寻找更适合的联合检测方法。
关键词： 手足口病     病毒核酸检测     肠道病毒71型     柯萨奇病毒A组16型    
Changes in pathogen constituent of EV71 and Cox A16 and combined detection methods of hand foot and mouth disease in Hangzhou, 2015
CHEN Shi-wei, WANG Jie, ZHOU Ren-xi, ZHOU Jun, CHEN Dong, WU Yi-dong     
Hangzhou Children's Hospital, Hangzhou 310014, Zhejiang, China
Corresponding author: WU Yi-dong, Email: wyd721@sina.com.
Abstract: Objective To analyze the changes in pathogen constituent of Human enterovirus 71 (EV71) and Coxsachie virus A16 (Cox A16) in children with hand foot and mouth disease (HFMD) in Hangzhou in 2015 and the characteristics of laboratory diagnostic methods of HFMD. Methods A total of 663 children diagnosed with HFMD from April 2015 to August 2015 were enrolled in this study. Enterovirus nucleic acid were detected by fluorescence quantitative RT-PCR and serum antibody of EV71 IgM and Cox A16 IgM were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Among the 663 children with HFMD, 388 (58.52%) were common nucleic acid positive and 127 (19.16%) were EV71 positive. Compared with the data of 2014, the differences in proportions of common nucleic acid positive group (χ2=166.306, P=0.000) and the EV71 positive group were significant (χ2=134.418, P=0.000), and 487 cases (73.45%) were mild ones, mainly in common nucleic acid positive group (65.91%, 321/487), and 176 cases (26.55%) were severe ones, mainly in EV71 positive group (43.75%, 77/176) and common nucleic acid positive group (38.07%, 67/176).The probability of severe cases was different in different groups (χ2=98.395, P=0.000). The severe case proportion was highest in EV71 group (60.63%, 77/127). The difference in positive rate between nucleic acid detection and serum antibody detection was significant (χ2=44.487, P=0.000). In 127 cases of EV71 infection, 59.85%(76/127) were positive in both nucleic acid detection and serum antibody detection, 40.15% (51/127) were either nucleic acid positive or serum antibody positive. In 64 cases of Cox A16 infection, 9.38%(6/64) were positive in both nucleic acid detection and serum antibody detection, 90.62%(58/64) were either nucleic acid positive or serum antibody positive. With the quantitative RT-PCR as the standard, the specificity in detection of EV71 and Cox A16 was higher (86.61%), but the sensitivity was lower relatively (69.49%). Conclusion Compared with 2014, the epidemic features of HFMD changed obviously. The detection of virus nucleic acid and antibody can increase the positive rate of laboratory detection, and clinical classification can facilitate the clinical treatment. As the increase of severe cases in common nucleic acid positive group, it is necessary to find a more suitable detection method.
Key words: Hand foot and mouth disease     Viral nucleic acid detection     Human enterovirus 71     Coxsachie virus A16    

手足口病是由肠道病毒 (Enterovirus，EV) 感染引起的儿童常见传染病，特别是5岁以下儿童为主要易感人群[1-2]。手足口病是一种自限性疾病，临床主要表现为发热，手、足、口皮疹或疱疹，若伴有神经系统损伤、脑炎、脑膜炎或肺出血等，则易发展为重症病例，导致患儿死亡。因此，尽早分型、针对性治疗是减少患儿重症病例发生的有效手段。目前对手足口病的诊断主要依据临床特征和实验室检测结果。手足口病的实验室确诊检测方法有肠道病毒核酸和抗体检测，病毒核酸检测分为肠道病毒通用型、肠道病毒71型 (Enterovirus 71，EV71) 和柯萨奇病毒A组16型 (Coxsackievirus A16，Cox A16)，免疫抗体检测有EV71-IgM和Cox A16-IgM。杭州市儿童医院是手足口病定点治疗单位，本研究采用核酸和抗体联合检测，并与2014年吴亦栋等[3]同期本院手足口病资料比较，分析手足口病流行特征，并对目前实验室诊断方法进行评价，以期为临床诊断和治疗提供最佳辅诊依据。

1 对象与方法 1.1 研究对象

选取2015年4-8月临床诊断为手足口病患儿663例为研究对象，依据国家卫生部颁布的“手足口病诊疗指南 (2010年版)”的诊断标准[4]，将有或无发热，伴手、足、口皮疹患儿诊断为轻症手足口病，出现程度不同的中枢神经系统表现 (如易惊、嗜睡、抽搐、肢体抖动、呕吐等)、肌痉挛、肺水肿、肺出血等诊断为重症手足口病。

1.2 研究方法 1.2.1 荧光定量反转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)

咽拭子样本进行一步法荧光定量RT-PCR检测，仪器采用ABI7500型实时荧光定量PCR基因扩增仪 (ABI公司，美国)。具体操作按试剂盒说明，核酸提取试剂盒由西安天隆生物科技有限公司提供；肠道病毒通用型核酸检测试剂盒、EV71核酸检测试剂盒、Cox A16核酸检测试剂盒 (均为单通道检测) 由中山大学达安基因股份有限公司提供，以该系列试剂盒的核酸检测阳性作为实验室诊断主要标准。663份标本均采用一步法实时荧光定量RT-PCR分别检测EV71、Cox A16和肠道病毒通用型RNA病毒。

1.2.2 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测定

血清EV71-IgM、Cox A16-IgM检测按试剂盒说明操作，EV71-IgM抗体和Cox A16-IgM抗体试剂盒由北京万泰生物药业股份有限公司提供，以该系列试剂盒的抗体检测阳性作为实验室诊断病例的辅助标准。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。计数资料组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 手足口病肠道病毒感染病原学的分布

663例临床诊断为手足口病的患儿，肠道病毒病原学分布通用核酸阳性为58.52%(388/663)，EV71阳性为19.16%(127/663)，Cox A16阳性为9.65%(64/663)，核酸抗体阴性为12.67%(84/663)。比较2014年同期本院数据[3]，通用核酸阳性比例为15.85%(169/1 066，χ2=166.306，P=0.000)，EV71阳性比例为64.63%(689/1 066，χ2=134.418，P=0.000)，差异有统计学意义，见表 1。

表 1 2014年与2015年杭州市手足口病患儿病原学分布 Table 1 Pathogens causing HFMD in children in Hangzhou, 2014 and 2015
组别 2014年 2015年
例数 构成比 (%) 例数 构成比 (%)
通用核酸阳性(1) 169 15.85 388 58.52
EV71阳性 689 64.63 1272 19.16
Cox A16阳性 117 10.98 64 9.65
核酸抗体阴性 91 8.54 84 12.67
 合计 1 066 100.00 663 100.00
  注：(1) 为非EV71、Cox A16的其他肠道病毒感染。
表选项
2.2 手足口病不同型别肠道病毒感染组别的轻症、重症比例

不同型别肠道病毒感染患儿中出现重症的比例差异有统计学意义 (χ2=98.395，P=0.000)，其中EV71阳性最高，为60.63%(77/127)，其他分别为Cox A16阳性29.69%(19/64)、通用核酸阳性17.27%(67/388)，核酸抗体阴性15.48%(13/84)，见表 2。

表 2 2015年杭州市手足口病不同型别肠道病毒感染患儿的轻、重症比例 Table 2 Proportion of mild and severe HFMD cases by different enteroviruses in Hangzhou 2015
组别 手足口病轻症病例 手足口病重症病例 总计
例数 构成比 (%) 例数 构成比 (%) 例数 构成比 (%)
通用核酸阳性(1) 321 82.73 67 17.27 388 100.00
EV71阳性 50 39.37 77 60.63 127 100.00
Cox A16阳性 45 70.31 19 29.69 64 100.00
核酸抗体阴性 71 84.52 13 15.48 84 100.00
 合计 487 73.45 176 26.55 663 100.00
  注：(1) 为非EV71、Cox A16的其他肠道病毒感染。χ2=98.395，P=0.000。
表选项
2.3 病毒核酸检测和血清抗体检出阳性率

比较EV71和Cox A16核酸检测和血清抗体检测，两种检测方法单阳性和双阳性分布差异有统计学意义 (χ2=44.487，P=0.000)。其中，127例EV71感染阳性患儿，核酸和抗体检出双阳性59.84%(76/127)，单阳性40.15%(51/127)；64例Cox A16感染阳性患儿，核酸和抗体检出双阳性9.38%(6/64)，单阳性90.62%(58/64)。通用核酸阳性组尚无相关抗体检测，因而检出均为单独核酸检测阳性100.00%(388/388)，见表 3。

表 3 手足口病两种检测诊断方法发生率比较 Table 3 Comparison of incidence of HFMD by two kinds of detection and diagnosis methods
组别 核酸抗体联合检测 临床分类(n) 百分率 (%)
重症 轻症 合计 重症 轻症 合计
EV71(n=127) EV71核酸阳性 50 44 94 39.37 34.65 74.02
EV71抗体阳性 66 43 109 51.97 33.86 85.83
EV71核酸与抗体双阳性 49 27 76 38.58 21.26 59.84
EV71核酸阳性+抗体阴性 11 7 18 8.66 5.51 14.17
EV71核酸阴性+抗体阳性 27 6 33 21.26 4.72 25.98
Cox A16(n=64) Cox A16核酸阳性 7 17 24 10.94 26.56 37.50
Cox A16抗体阳性 14 32 46 21.88 50.00 71.88
Cox A16核酸与抗体双阳性(2) 1 5 6 1.56 7.81 9.38
Cox A16核酸阳性+抗体阴性 5 13 18 7.81 20.31 28.12
Cox A16核酸阴性+抗体阳性 12 28 40 18.75 43.75 62.50
通用核酸阳性组(1)(n=388) 仅通用核酸阳性 67 321 388 17.27 82.73 100.00
核酸抗体阴性组 (n=84) 核酸与抗体双阴性 13 71 84 15.48 84.52 100.00
  注：(1) 为非EV71、Cox A16的其他肠道病毒感染；(2)χ2=44.487，P=0.000。
表选项
2.4 核酸和抗体检测结果

EV71、Cox A16两种检测方法配对χ2检验McNemar's检验，以核酸定量RT-PCR为标准，EV71/Cox A16-IgM抗体特异度为86.61%(472/545), 敏感度为69.49%(82/118)，见表 4。结合文献报道[3]，抗体检测与核酸检测比较差异有统计学意义 (χ2=170.403，P=0.000)，通过联合检测可以提高检测阳性率。

表 4 EV71/Cox A16核酸与抗体方法检测结果比较 (份) Table 4 Comparison of detection results by EV71 and Cox A16 nucleic acid detection and serum antibody detection
方法 EV71/Cox A16核酸定量RT-PCR 总计
阳性 阴性
EV71/Cox A16-IgM 阳性 82 73 155
阴性 36 472 508
合计 118 545 663
表选项
3 讨论

2015年杭州市手足口病患儿以通用核酸阳性为主要型别，占58.52%，EV71和Cox A16共占总比例的28.81%。比较2014年本院同期资料[3]，通用核酸阳性所占比例明显增多，EV71明显减少，说明病原学构成特征有变化。手足口病患儿重症比例显著下降，重症组EV71阳性明显减少而通用核酸阳性明显增多，但EV71仍为手足口病重症的主要类型。通用核酸阳性已取代Cox A16为第2位。本研究EV71所占比例下降幅度大，可能与总体上病毒类型所占比例发生了变化有关。不同型别的重症发生率比较，EV71出现重症病例的比例最高 (60.63%)，表明EV71仍是最易发展为手足口病重症的型别，临床应特别重视。

核酸和抗体检测作为实验室的确诊方法以及分型依据，对临床辅助诊断与治疗方案建立必不可少。对于Cox A16仅做核酸检测易造成漏诊，建议在做核酸检测的基础上同时检测抗体。EV71、Cox A16两种检测方法配对χ2检验McNemar's检测方法差异有统计学意义。以核酸定量RT-PCR为标准，EV71/Cox A16-IgM抗体特异度为86.61%，敏感度69.49%。由于单阳性检出的比例较联合检出偏低，因此在临床上可以考虑用2种方法联合使用来提高检出率，特别是对重症病例的识别和预防有重大意义。由于血清抗体检测的型特异性很强，不同型别的肠道病毒感染极少有交叉免疫，而EV71或Cox A16抗体检测方法，如果是其他型别的肠道病毒感染，结果极可能是阴性。考虑到通用核酸阳性组所占比例明显增多，且重症手足口病中通用核酸阳性组38.07%(67/176) 也占相当比例，因而对通用核酸阳性病毒感染，有必要寻找新的检测方法，以明确哪些肠道病毒容易引起重症手足口病。有文献报道对非EV71和非Cox A16肠道病毒标本进行核苷酸序列测定，发现Cox A10是引起宁夏回族自治区2013年手足口病的常见病原体[5]。因此，重症病例进行测序研究，对通用核酸阳性病毒感染引发的手足口病尤其是重症手足口病的防治具有重要意义。

本研究中有一部分核酸和抗体检查均为阴性的样本，相关资料一般将手足口病型别分为EV71、Cox A16及通用核酸阳性，并未将双阴性的型别独立出来。然而，双阴性的病例在临床诊断中占一定比例 (12.66%)。其原因可能是病毒变异或者其他病毒感染造成与手足口病相似的临床特征，还有检测样本 (如咽拭子和粪便等) 类型不同引起的阳性率差异[6]，此外，采样周期不合格以及排出病毒时间差异等原因都会造成一定的假阴性结果，应引起临床和实验室的重点关注。

手足口病流行特征每年都有变化，且重症病例不同年份之间差别很大，可能与造成流行的肠道病毒优势型别有关。2014年和2015年杭州市手足口病病例主要以轻症为主，需进一步了解杭州市手足口病病毒型别构成变化特征，并不断引入新的检测方法进行流行病学研究，为临床提供最佳辅诊依据。

作者贡献:

陈士伟  ORCID：0000-0003-1237-3536

陈士伟：论文设计，数据分析，文章撰写

王洁、周仁希：数据的收集

周俊：核酸检测

陈东：免疫抗体检测

吴亦栋：论文设计与撰写指导，数据核对

参考文献
[1] Xing WJ, Liao QH, Viboud C, et al. Hand, foot, and mouth disease in China, 2008-12: an epidemiological study[J]. Lancet Infect Dis , 2014, 14 (4) : 308–318. DOI:10.1016/S1473-3099(13)70342-6
[2] Wang JJ, Cao ZD, Zeng DD, et al. Epidemiological analysis, detection, and comparison of space-time patterns of Beijing hand-foot-mouth disease (2008-2012)[J]. PLoS One , 2014, 9 (3) : e92745. DOI:10.1371/journal.pone.0092745
[3] Wu YD, Zhou J, Chen D, et al. Application of combined detection of enterovirus nucleic acid and antibody in early etiological diagnosis for hand-foot-and-mouth disease[J]. Chinese Journal of Laboratory Medicine , 2015, 38 (6) : 397–401. (in Chinese) 吴亦栋, 周俊, 陈东, 等. 肠道病毒核酸与抗体联合检测在手足口病病原早期诊断中的应用[J]. 中华检验医学杂志 , 2015, 38 (6) : 397–401.
[4] Ministry of Health of the People's Republic of China. Diagnosis and treatment guideline on hand-foot-mouth disease (2010)[J]. International Journal of Respiration , 2010, 30 (24) : 1473–1475. (in Chinese) 中华人民共和国卫生部. 手足口病诊疗指南 (2010年版)[J]. 国际呼吸杂志 , 2010, 30 (24) : 1473–1475.
[5] Ma JT, Yuan F, Chen H, et al. Genetic characteristics of VP1 region of coxsackievirus A10 strains isolated from hand foot and mouth disease patients in Ningxia Hui Autonomous Region, 2013[J]. Chinese Journal of Epidemiology , 2015, 36 (7) : 734–737. (in Chinese) 马江涛, 袁芳, 陈慧, 等. 宁夏回族自治区2013年手足口病患者柯萨奇病毒A组10型分离株VP1区基因特征分析[J]. 中华流行病学杂志 , 2015, 36 (7) : 734–737.
[6] Yue MN, Wu YD, Zhou J, et al. The testing results analysis of enterovirus from children infected with HFMD[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology , 2014, 24 (22) : 3262–3264. (in Chinese) 岳美娜, 吴亦栋, 周俊, 等. 手足口病患儿肠道病毒检测结果分析[J]. 中国卫生检验杂志 , 2014, 24 (22) : 3262–3264.