根据菌体O抗原的不同，霍乱弧菌可分为206个血清群。其中，O1群和O139群可引起霍乱的暴发和流行，而非O1/O139血清群霍乱弧菌不致病或偶然引起轻度腹泻，也偶致肠道外感染，主要表现为散发。近年来，国内外也有非O1/O139群霍乱弧菌导致聚集性病例的相关报道。2014年12月，广州市某电池厂发生一起食物中毒事件，患者主要症状为腹泻、腹痛和呕吐等，根据流行病学调查、临床表现和实验室检测结果，参照《食物中毒诊断标准及技术处理原则》^[1]，证实为一起非O1/O139群霍乱弧菌食物中毒。中毒患者经过及时对症治疗后症状消失，均痊愈出院。为进一步了解该部分菌株的耐药表型和分子特征，本研究对5株病例分离株和1株环境分离株进行了相关毒力基因检测、药敏试验及脉冲场凝胶电泳 (pulsed field gel electrophoresis，PFGE) 分析同源性。

从10份患者粪便样本、5份环境涂抹样、3份熟食中检测出6株非O1/O139群霍乱弧菌 (5株分离自患者粪便样本，1株分离自环境涂抹样本)，保存菌株并进一步做相关病原学分析。

碱性蛋白胨水、TCBS培养基、四号培养基、盐胨水、血平板等试剂均购自广东环凯微生物有限公司；O1/O139群霍乱弧菌血清购自宁波天润生物药业有限公司；生物梅里埃革兰阴性菌GN生化鉴定卡、Oxoid药敏纸片购自广州市千江企业有限公司；核酸磁珠提取试剂、毒力基因引物和探针购自中山大学达安基因股份有限公司，NotⅠ酶 (美国Promega公司)、Seakem Gold琼脂糖 (美国Cambrex公司)、蛋白酶K (Merck公司) 由广东省疾病预防控制中心 (CDC) 提供，所有试剂均在有效期内使用。

梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪；ABI7500荧光定量PCR仪；Smart32核酸提取仪；CHEF Mapper脉冲场凝胶电泳仪和Gel Doc EQ凝胶成像系统 (美国Bio-Rad公司)；比浊仪 (美国Bio-Rad公司)。

参照GB 4789-2013相关标准^[2]和《霍乱防治手册》第6版^[3]对食物中毒中采集的样品进行致病菌检测，利用梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪对分离菌株做生化鉴定并进一步做血清凝集实验。由于供餐单位没有对48 h内食物留样，3份熟食为当天出炉加工食品，导致对致病菌活菌的检出有一定的影响，因此对现场采集的粪便样本、环境涂抹样、熟食样进行增菌培养后利用荧光定量聚合酶链反应 (PCR) 方法进行致病菌核酸检测，分别检测了沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和金黄色葡萄球菌。

参照世界卫生组织 (WHO) 推荐的K-B纸片法进行，选用Oxoid公司药敏纸片，试验所选抗生素包括氨苄西林 (10 μg/片)、头孢克肟 (5 μg/片)、头孢拉定 (30 μg/片)、阿米卡星 (30 μg/片)、妥布霉素 (10 μg/片)、庆大霉素 (10 μg/片)、多粘菌素B (300 IU/片)、诺氟沙星 (10 μg/片)、环丙沙星 (5 μg/片)、复方新诺明 (23.75 μg/1.25 μg)、呋喃唑酮 (100 μg/片)、四环素 (30 μg/片)、吡哌酸 (30 μg/片)、红霉素 (15 μg/片)、氯霉素 (30 μg/片)。标准参考菌株为大肠埃希菌 (ATCC25922)。结果判定参照美国临床和实验室标准协会CLSI出版的《抗菌药物敏感性试验标准 (2014版M 100-S24)》^[4]。

利用磁珠提取法对菌株进行DNA提取后进一步检测霍乱肠毒素基因 (ctxA)、毒力协同调节菌毛基因 (tcpA)、毒力表达调控基因 (toxR)、溶血素基因 (hlyA) 和肠毒素基因 (ST)。引物和探针由中山大学达安基因股份有限公司合成，其序列及产物大小参照表 1。根据荧光定量PCR-Taman探针法试剂盒说明要求，配置总体积为20 μl的反应体系 (反应液Ⅰ 16.5 μl、反应液Ⅱ 1.5 μl、样品模板2 μl)，检测反应条件：94 ℃，3 min，1个循环；93 ℃，15 s；55 ℃，25 s (收集荧光信号)；72 ℃，30 s，40个循环。

参照美国CDC PulseNet霍乱弧菌的PFGE标准操作程序，采用NotⅠ内切酶对菌株进行酶切后利用CHEF Mapper脉冲场凝胶电泳仪进行电泳。电泳结束后采用Gel Doc EQ凝胶成像系统读取图像，获得图像最后通过BioNumerics 6.6软件进行同源性分析。

从TCBS平板和四号平板挑选可疑菌落，接种于营养琼脂斜面进行生化试验及血清凝集试验，结果显示6株菌株经梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴仪进行生化鉴定结果显示为霍乱弧菌。菌株氧化酶和动力均为阳性，O129(10 μg/片、150 μg/片) 敏感实验均为敏感。用霍乱弧菌O1/O139血清做血清凝集试验，6株菌株均不凝集，生理盐水对照均未发生自凝。将分纯菌株接种到5%绵羊血平板中进行溶血试验^[5]，37 ℃培养24 h后观察结果显示6株菌株均出现β溶血现象。利用荧光定量PCR方法对沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和金黄色葡萄球菌核酸筛查，结果显示18份样品中8份患者粪便样本、2份环境涂抹样、1份熟食均为霍乱弧菌核酸阳性，阳性率高达61.1%，6株菌株均来自11株霍乱弧菌核酸阳性样本。

耐药谱分析显示6株菌株均对氨苄西林、头孢克肟、头孢拉定、阿米卡星、妥布霉素、多粘菌素B和庆大霉素7种抗生素耐药，对诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、呋喃唑酮、四环素、吡哌酸、红霉素、氯霉素敏感。

利用荧光定量PCR-Taman探针方法对6株菌株进行ctxA、tcpA、toxR、hlyA和ST检测，结果见表 2。

对6株菌株经NotⅠ内切酶消化后，进行PFGE分离酶切片段，Gel Doc EQ凝胶成像系统读取图像，获得图像最后通过BioNumerics 6.6软件进行同源性分析，结果见图 1。6株菌株电泳条带比对后相似度100%同源。

图 1 菌株PFGE图谱分析 Figure 1 PFGE analysis of strains

图选项

非O1/O139群霍乱弧菌是指除O1和O139群霍乱弧菌以外其他血清群的霍乱弧菌^[6]，广泛存在于环境中，尤其是水体和海产品中，是引起急性腹泻的主要病原菌之一，临床表现为轻症胃肠炎或严重腹泻^[7]。有关报道提示，非O1/O139群霍乱弧菌的主要致病因子有外膜蛋白、肠毒素、蛋白酶、溶血素和转录调节因子等^[8-9]，由hly A基因编码的溶血素可以在细胞膜上形成孔隙而破坏靶细胞，在兔结肠结扎试验中，可引起血液和黏液的产物积聚^[10]。toxR基因的活性主要影响霍乱CT毒素的表达，它的存在可以激活霍乱毒素的转录^[11]。2014年12月广州地区某单位陆续有员工出现腹泻、腹痛、呕吐急性肠胃炎症状，经流行病现场个案调查和采样后，利用荧光定量PCR法和传统分离培养法进行致病菌筛查及分离，荧光定量PCR检测结果显示18份样品中8份患者粪便样本、2份环境涂抹样、1份熟食均为霍乱弧菌核酸阳性，阳性率高达61.1%。分离培养出6株非O1/O139群霍乱弧菌，其中5株来源于患者，1株来源于环境涂抹冷柜内壁，菌株接种于5%绵羊血平板中进行溶血试验出现β溶血环，提示菌株产生溶血素。对6株非O1/O139霍乱弧菌进行毒力基因检测，结果显示6株菌株均检出toxR和hly A基因，携带率为100.0%。未检出ctxA、tcpA和ST基因。6株菌株的PFGE结果显示电泳条带基本相同，提示病例株与环境株高度同源。菌株药敏试验结果显示对诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、呋喃唑酮、四环素、吡哌酸、红霉素和氯霉素敏感。对氨苄西林、头孢克肟、头孢拉定、阿米卡星、妥布霉素、多粘菌素B和庆大霉素7种抗生素耐药，菌株出现多重耐药特性，因此临床上进行抗生素治疗时，应根据菌株抗生素敏感模式对患者进行用药，防止滥用抗生素而引起耐多药细菌的产生。

实验室检测结果提示，本次食物中毒是由产溶血素的非O1/O139霍乱弧菌引起的，根据菌株的药敏实验结果，患者治疗用药可首选呋喃唑酮、诺氟沙星和环丙沙星等敏感抗生素。由于患者粪便样和供餐制作场所均检出相同致病菌，提示供餐单位应加强对食品加工场所、制作工具及食品保鲜冷柜的彻底消毒和清洗，并做好48 h食物留样，防止类似事故发生。

作者贡献:

徐秋琼  ORCID：0000-0001-5132-6287

徐秋琼：主要负责细菌鉴定、毒力基因检测，实验结果分析及文章撰写

李柏生：主要负责指导实验开展及菌株脉冲场电泳同源性分析

余泳红、单桂花：主要负责细菌分离接种及相关生化试验