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文章信息
- 田国忠, 崔步云, 赵鸿雁, 姜海, 朴东日
- TIAN Guo-zhong, CUI Bu-yun, ZHAO Hong-yan, JIANG Hai, PIAO Dong-ri
- 一起羊种布鲁氏菌病暴发的流行病学和分子特征研究
- Studies on epidemiology and molecular characteristics of Brucella melitensis during an outbreak of brucellosis
- 疾病监测, 2017, 32(3): 211-215
- Disease Surveillance, 2017, 32(3): 211-215
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.03.011
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文章历史
- 收稿日期:2016-11-02
布鲁氏菌病 (布病) 是一种人畜共患性传染病,其病原体布鲁氏菌是由Bruce[1]在19世纪60年代发现。尽管病原体认识较久,但目前该病仍然在全世界流行,严重影响着人类、家畜和野生动物的身体健康,影响最重的是东地中海盆地、中东、阿拉伯半岛、墨西哥、美国中部和南部、中亚和印度次大陆[2]。近几年,我国布病发病率迅速增加,发病区域遍布全国各地[3],而且布病暴发疫情在全国各地的某些地区时常发生,特别是养殖场[4-5]。
到目前为止,既能感染动物,也能感染人类的布鲁氏菌主要有6种,包括牛种布鲁氏菌Brucella abortus,主要宿主为牛;羊种布鲁氏菌Brucella melitensis,主要宿主为绵羊和山羊;猪种布鲁氏菌Brucella suis,主要宿主为猪;犬种布鲁氏菌Brucella canis,主要宿主为犬类;绵羊附睾布鲁氏菌Brucella ovis,主要宿主为绵羊和山羊;布鲁氏菌Brucella inopinat,分离自人的乳腺中。除此之外,最近鉴定的一个种Brucella papionis分离自狒狒[6],其是否能感染人,还没有病例报告。
抗生素治疗布病是有效的方法,但是由于广泛的使用抗生素,使布鲁氏菌产生诸多耐药现象,这种耐药给布病的治疗与诊断带来很多的困难,研究发现不同的布鲁氏菌种和不同地域分离的布鲁氏菌具有不同的耐药特征[7]。本调查研究一个相对封闭的羊养殖场发生的人和羊感染羊种布鲁氏菌暴发疫情,采用的实验方法包括血清学、病原体鉴定、药物敏感性实验和分子特征分析。
1 材料与方法 1.1 标本采集、分离与培养对养殖场的工作人员和有流产症状的羊进行流行病学调查和血液细菌分离培养。2014年3月20日,采集18名工作人员和8只羊的血液,其中0.5 ml的血液立即注射到布氏琼脂培养基上,涂匀,置于37 ℃,5%的CO2孵箱中培养,余下血液分离血清。菌株鉴定方法参见文献[8-9],包括生长是否需要CO2环境,能否产生H2S、硫堇和复红的抑菌性实验和布鲁氏菌特异噬菌体的裂解性实验 (包括TB、BK2、R、R/O和R/C噬菌体)。标准菌株包括牛种544A菌株、猪种1330S菌株、羊种16M菌株和犬种RM6/66菌株。医学伦理批准号:ICDC 2014005。
1.2 血清学实验采用试管凝集法 (SAT) 检测人和羊血液中的布鲁氏菌抗体[10-11],试管凝集抗原试剂由中国疾病预防控制中心 (CDC) 传染病预防控制所布病室制备,按照国家布病诊断标准进行结果判断[11],血清滴度≥1 : 50(+ +) 为阳性结果。
1.3 药物敏感性实验采用世界卫生组织 (WHO) 推荐的纸片扩散法 (K-B法) 检测菌株的药物敏感性[12]。其检测方法是将含有一定量抗菌药物的纸片贴于含有定量测试菌的药物琼脂平板上,药物纸片吸收琼脂中的水分溶解后会向纸片周围的琼脂平板扩散,并形成以纸片为中心从内而外药物浓度递减的梯度浓度,当药物浓度大于最低抑菌浓度时,细菌生长被抑制,从而可在药物纸片的四周形成透明抑菌圈。测量抑菌圈的直径大小,根据判断标准鉴定菌株是敏感,还是耐药。本研究对分离的菌株进行13种药物敏感性实验,包括环丙沙星 (CIP)、左氧氟沙星 (LEV)、强力霉素 (DO)、头孢曲松 (CRO)、诺氟沙星 (NOR)、米诺霉素 (MH)、莫西沙星 (MXF)、氧氟沙星 (OFX)、利福平 (RD)、链霉素 (S)、复方新诺明 (SXT)、阿奇霉素 (AZM) 和克拉霉素 (CLR)。
1.4 细菌基因组DNA的提取血液细菌基因组DNA的提取,按照试剂盒的说明进行 (Dneasy Tissue Kit,Qiagene公司)。
1.5 多位点串联重复序列分析 (multi-variable-number tandem repeat analysis MLVA)MLVA方法见文献[13-14]。包括16个基因位点 (Bruce04、Bruce06、Bruce07、Bruce08、Bruce09、Bruce11、Bruce12、Bruce16、Bruce18、Bruce19、Bruce21、Bruce30、Bruce42、Bruce43、Bruce45、Bruce55),16对引物,引物序列及PCR扩增条件见文献[13-14],对引物进行了修改,将所有的引物5′端标记为6-FAM荧光染料。PCR扩增产物由公司采用毛细管电泳技术 (ABI PRISM 3130自动荧光毛细管DNA测序仪) 进行PCR产物片段长度检测,之后通过DNA片段长度比对,换算出串联重复数,将计算的16个位点的串联重复数值资料输入到http://mira.u-psud.fr/,与数据库进行比较,以确定菌株基因的序列型和MLVA基因型。
1.6 多位点序列分析 (multilocus sequence typing,MLST)MLST方法见参考文献[15-16],共9个保守基因 (gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ、int-hyp和omp25)。引物序列及PCR扩增条件见文献[15-16],PCR扩增产物提交公司进行核苷酸序列测定,通过序列比对,获得基因序列型和MLST基因型。
2 结果 2.1 流行病学调查重庆市某养殖场于2012年6月引进309只大耳土耳其种羊,该批次羊种未进行检疫,没有进行疫苗免疫。该养殖场位于重庆市郊区,距重庆市100 km农村一座山上,周围2 km无村庄,该养殖场工作人员来自周围的村庄,工作人员18人,年龄在23~62岁之间,多数为50岁左右。直接接触人员10人,包括兽医、饲养员、卫生员和羊圈围栏焊接工等。间接接触6人,包括管理人员和直接接触人员家属。无直接接触者2人,为养殖场工作人员家属。接触时间3~20个月不等,均出现过类似感冒症状,就诊于村诊所,或者在家自服药物治疗,未有住院史,见表 1。2014年2月发现10只母羊出现流产现象,期间兽医曾对流产羊进行过抗生素治疗。本次调查工作人员18名,羊8只,进行布鲁氏菌血清学检测和血液细菌分离培养。
菌株 | 来源 | 性别 | 年龄 | 从事职业 | 接触时长(月) | 接触方式 | 症状 | 试管凝集(1) | 细菌培养 |
CQ-1 | 人 | 男 | 62 | 兽医 | 20 | 直接接触 | 无 | + | |
CQ-2 | 人 | 男 | 53 | 兽医 | 20 | 直接接触 | 无 | - | |
CQ-3 | 人 | 男 | 28 | 兽医 | 12 | 直接接触 | 无 | - | |
CQ-4 | 人 | 男 | 23 | 兽医 | 4 | 直接接触 | 无 | - | |
CQ-5 | 人 | 男 | 51 | 焊工 | 19 | 直接接触 | 无 | + | |
CQ-6 | 人 | 男 | 57 | 种植 | 13 | 间接接触 | 无 | - | |
CQ-7 | 人 | 女 | 50 | 种植 | 19 | 间接接触 | 无 | + | |
CQ-8 | 人 | 女 | 49 | 饲养 | 19 | 直接接触 | 无 | + | |
CQ-9 | 人 | 男 | 45 | 管理 | 19 | 间接接触 | 无 | - | |
CQ-10 | 人 | 男 | 39 | 管理 | 19 | 间接接触 | 无 | - | |
CQ-11 | 人 | 男 | 51 | 卫生 | 13 | 直接接触 | 无 | + | 羊种Ⅲ型 |
CQ-12 | 人 | 女 | 53 | 饲养 | 13 | 直接接触 | 无 | - | |
CQ-13 | 人 | 男 | 52 | 管理 | 19 | 间接接触 | 无 | + | |
CQ-14 | 人 | 男 | 42 | 管理 | 19 | 间接接触 | 无 | - | |
CQ-15 | 人 | 女 | 49 | 兽医 | 19 | 直接接触 | 无 | - | |
CQ-16 | 人 | 女 | 49 | 家属 | 19 | 无接触 | 无 | - | |
CQ-17 | 人 | 女 | 58 | 家属 | 19 | 无接触 | 无 | - | |
CQ-18 | 人 | 男 | 23 | 兽医 | 4 | 直接接触 | 无 | + | 羊种Ⅲ型 |
CQ-123 | 羊 | 母羊 | 流产 | - | |||||
CQ-147 | 羊 | 母羊 | 流产 | + | |||||
CQ-154 | 羊 | 母羊 | 流产 | + | 羊种Ⅲ型 | ||||
CQ-159 | 羊 | 母羊 | 流产 | + | 羊种Ⅲ型 | ||||
CQ-181 | 羊 | 母羊 | 流产 | - | |||||
CQ-213 | 羊 | 母羊 | 流产 | - | |||||
CQ-237 | 羊 | 母羊 | 流产 | + | 羊种Ⅲ型 | ||||
CQ-292 | 羊 | 母羊 | 流产 | + | |||||
注:(1)“+”表示布鲁氏菌血清试管凝集试验阳性,“-”表示布鲁氏菌血清试管凝集试验阴性。 |
18名工作人员的血液标本中有2名培养出细菌,8只羊的血液有3只培养出细菌,形态为革兰阴性小杆菌,生长时不需要CO2,不产生H2S,在硫堇 (1 : 25 000) 和复红 (1 : 50 000) 环境中均能生长,噬菌体BK2裂解,Tb、R、R/O和R/C不裂解,可与布鲁氏菌A血清和M血清凝集,确定为羊种生物Ⅲ型布鲁氏菌,菌株分别命名为CQ-154、CQ-159、CQ-237、CQ-18和CQ-11(表 1)。血清SAT阳性率为46.5%(12/26),其中工作人员阳性率为38.89%(7/18),羊为62.5%(5/8)。工作人员血液细菌分离阳性率为11.11%(2/18),2名工作人员接触时间分别为3个月和12个月,羊血液细菌分离率为37.5%(3/8)。
2.3 MLVA结果本次分离的5株布鲁氏菌,16个串联重复序列位点Bruce04-Bruce06-Bruce07-Bruce08-Bruce09-Bruce11-Bruce12-Bruce16-Bruce18-Bruce19-Bruce21-Bruce30-Bruce42-Bruce43-Bruce45-Bruce55的基因型分别为:204002菌株:4-1-4-5-3-3-13-6-4-20-8-6-3-2-3-2,CQ-18菌株型:5-1-4-5-3-3-13-7-4-20-8-6-3-2-3-2,CQ-159、CQ-237和CQ-11菌株:4-1-4-5-3-3-13-7-4-20-8-6-3-2-3-2。其差异的串联重复序列位点为Bruce04和Bruce16,串联重复序列的重复数分别为4个或5个,6个和7个的差异。
2.4 MLST结果MLST 9个位点gap-aroA-glk-dnaK-gyrB-trpE-cobQ-omp25-inthyp的序列号为3-2-3-2-1-5-3-8-2,MLST基因型为ST8。
2.5 药物敏感性实验对分离的5株布鲁氏菌菌株进行了13种药物敏感性实验,所有菌株对CIP、LEV、DO、CRO、NOR、MH、MXF、OFX、RD和S敏感,从羊分离的2株菌CQ-154和CQ-237对SXT敏感,1株羊分离的菌株CQ-159和2株人分离的菌株CQ-18和CQ-11对SXT耐药,所有5株菌对AZM和CLR耐药。从羊血液分离的菌株对所有药物的抑菌环直径大于从人血液分离的菌株,见表 2。
抗生素 | 菌株 (抑菌环直径单位:cm) | ||||
CQ-154 | CQ-159 | CQ-237 | CQ-18 | CQ-11 | |
环丙沙星 | 39 | 36 | 38 | 30 | 32 |
左氧氟沙星 | 42 | 44 | 40 | 35 | 32 |
强力霉素 | 50 | 44 | 50 | 40 | 40 |
复方新诺明 | 34 | 0 | 27 | 0 | 0 |
头孢曲松 | 50 | 44 | 44 | 36 | 35 |
诺氟沙星 | 27 | 25 | 25 | 16 | 20 |
阿奇霉素 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
克拉霉素 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
米诺霉素 | 48 | 22 | 44 | 40 | 38 |
莫西沙星 | 32 | 38 | 35 | 30 | 25 |
氧氟沙星 | 32 | 32 | 32 | 25 | 30 |
利福平 | 24 | 24 | 25 | 19 | 20 |
链霉素 | 30 | 30 | 30 | 23 | 24 |
布病的暴发与流行,已经成为世界关注的焦点,美国CDC将布鲁氏菌归结为生物战剂B类加以管理[17]。其感染的途径主要有:摄入含有布鲁氏菌的牛奶 (山羊、绵羊、骆驼) 或其产品,结膜和皮肤的感染 (擦伤、意外接种),呼吸道 (例如通过吸入、喷雾和气溶胶)[2]。
如果不考虑接触史和流行病学资料,布病的早期临床诊断是困难的,难以与其他疾病鉴别,因此造成了非流行区的布病患者确诊时间往往是在发病之后的几个月,甚至几年。主要原因:(1) 布病的潜伏期波动较大,具有持久的致病力和较强的感染性 (≤100个菌体即可患病),其感染的潜伏期为1~4周。(2) 其临床症状和体征具有多样性[18],临床症状表现为非特异性的发热综合征 (周期或波状热,包括肌肉疼痛、背部疼痛、出汗和疲劳)。(3) 与其他传染性和非传染性疾病症状具有相似性,造成了不同的临床诊断结果,引起误诊,如:肺结核、伤寒、感染性心内膜炎、钩端螺旋体病、隐球菌病组织胞浆菌病、传染性单核细胞增多症、疟疾、胶原蛋白血管疾病、慢性疲劳综合征和恶性肿瘤等。(4) 不同的病程 (急性、亚急性或慢性),涉及多器官和组织以及局灶性病症,造成诊断困难[19]。有的患者甚至表现为慢性精神病症状,主要是抑郁症和精神障碍[20]。此次该养殖场患布病的工作人员没有进行正规就诊与治疗,原因是目前我国布病疫区主要发生在东北和西北等多草原地区,其他地区布病只是散发,为非疫区。重庆市至2013年人间布病累计78例,多为散发,而该养殖场位于农村山区,以往无布病病例出现,患者没有防范意识,虽然出现过类似感冒症状,未诊断为布病,未进行正规治疗,因此导致病菌一直存在于机体内。
布病的诊断需要考虑多个方面,包括接触病史、症状与体征、常规血液学的生化实验、血清学和分子生物学检测等。细菌培养阳性是临床诊断的金标准。应用自动血培养系统,培养1周的时间,40%~90%的急性期患者可获得阳性结果。慢性患者和局灶性或复杂病例只有5%~20%的阳性率,骨髓培养的阳性率比血液高出15%~20%。对多数血清学阳性患者都可以培养分离到病原体[21]。最常见受损的器官组织包括骨关节 (10%~70%,主要是关节)、生殖系统 (男性6%~8%、女性2%~5%)、神经 (3%~5%)、心脏 (1%~3%)、肺 (1%~2%) 和肾 ( < 1%)。该病死亡率很低 ( < 1%),几乎全部来源于心脏并发症[22-23]。这种多器官的病变,也是造成临床上误诊误判的原因。
血清学检测是布病实验室诊断的依据之一,RBPT快速简便,但是对慢性和复杂病例具有较高的假阴性率。SAT自1897年开始应用至今,仍然是布病诊断的基石。该方法也是本次患者确诊的主要依据。
2011年姜海等[24]分析了2005 2009年10个省分离的69株羊种菌药敏实验,所有菌除了对AZM和CLR耐药外,对其他10种抗生素均敏感。本研究发现新分离的羊种布鲁氏菌出现了对SXT敏感菌和耐药菌同时存在的现象,而且从人体内分离的菌株对药物的敏感性明显的低于羊体内分离的菌株。在这个相对封闭的羊养殖场,出现耐药的原因是在这个地区,SXT是普遍使用的抗生素,包括人类和畜类,因此引发了布鲁氏菌的耐药机制,包括其他抗生素出现了敏感性降低的现象。
本次暴发病例,排除了疫苗株引起的原因。我国目前使用的布病疫苗包括3种:S2(来自猪种布鲁氏菌),M5(来自羊种Ⅰ型布鲁氏菌) 和S19(来自牛种布鲁氏菌),本次分离的菌株是羊种Ⅲ型布鲁氏菌,因此可以排除疫苗接种引起感染的可能。
从分子特征上分析菌株,该次分离的布鲁氏菌仍为羊种生物Ⅲ型菌株,串联重复序列在某些位点出现了重复数的变异,差异位点为Bruce04和Bruce16,这2个位点是布鲁氏菌株易变位点,MLST不变,为ST8,这个基因型也是我国羊种布鲁氏菌主要的基因型[15],说明在这个局限的环境内,菌株发生了局部的核苷酸变异,但没有影响到菌株生物型的改变。
作者贡献:
田国忠 ORCID:0000-0002-5151-2909
田国忠:负责该研究项目的设计和文稿的撰写
崔步云:负责现场流行病学调查和标本采集
赵鸿雁:负责标本的分离培养和菌株鉴定
姜海:负责菌株的分子流行病学研究
朴东日:负责菌株的生物学鉴定和文稿的撰写工作
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