早期多粘菌素应用因为其肾毒性和神经毒性受到限制^[1]。近年来，因为其在治疗多重耐药革兰阴性菌引起的感染方面取得较好疗效^[2]，重新获得关注。现临床上常用的为多粘菌素B和E，多粘菌素E多应用于动物，多粘菌素B主要应用于人。然而，随着该药在临床上的应用，已经发现革兰阴性菌对多粘菌素产生耐药性^[3]。最新研究发现，细菌对多粘菌素的抗性显著增加，并通过携带mcr-1基因的质粒介导，将其耐药性传递给其他菌株^[4]。因此，加强对多粘菌素耐药性的监测对指导临床用药具有重要意义。目前，针对肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌对多粘菌素的耐药研究较多，沙门菌对多粘菌素的耐药研究多见于动物源性沙门菌对多粘菌素E的相关研究^[5-6]。本研究对分离自食品、腹泻患者粪便、动物粪便或肠内容物的沙门菌进行多粘菌素的药物敏感性试验及mcr-1基因检测，初步探究沙门菌对多粘菌素的耐药情况，为临床使用多粘菌素治疗沙门菌，特别是多重耐药沙门菌感染提供一定的依据。

随机选取2011-2014年共404株沙门菌进行试验。其中，2011年4株(0.99%)，2012年24株(5.94%)，2013年344株(85.15%)，2014年32株(7.92%)。菌株来自北京(108株)、云南(108株)、深圳(70株)、天津(31株)、内蒙古(44株)、厦门(13株)、河北(7株)、河南(6株)、贵州(5株)等12个省(直辖市、自治区)及国外(8株)。其中，分离自食品的沙门菌共72株(17.82%)，除2株来源于厦门市，其余70株菌来自深圳市。分离自野生动物(红嘴鸥和鼠)的沙门菌共128株(31.68%)，84株来源于云南省昆明市，44株来源于内蒙古自治区赤峰市。分离自腹泻患者粪便的沙门菌共204株(50.50%)，来自于除深圳以外的各个省市，其中北京市最多，为86株。明确血清型的菌株共189株，包括鼠伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌、肠炎沙门菌等38种血清型，见图 1、2。实验用菌株均来自中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所腹泻病室，均采用API 20E试剂条及血清凝集试验进行了确认。沙门菌抗血清购自丹麦国家食品研究所并在有效期内使用。

图 1 分离自食物菌株血清型构成比 Figure 1 Proportion of serotypes of Salmonella from food samples 注：其他血清型，共包括26种血清型，每种血清型包含的菌株数均 < 3株

图选项

图 2 分离自人粪便菌株血清型构成比 Figure 2 Proportion of serotypes of Salmonella from human stool samples 注：其他血清型，共包括26种血清型，每种血清型包含的菌株数均 < 3株

图选项

采用微量肉汤稀释法测试404株沙门菌对多粘菌素B和E的敏感性。2种抗生素浓度范围为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/ml。药敏板由上海星佰生物技术有限公司订制，实验步骤按照说明书进行，具体包括：(1) 制备菌悬液：挑取纯菌培养的新鲜菌落于2~3 ml灭菌生理盐水中，用0.5麦氏浊度比浊，调菌液浓度至1.5×10⁸ CFU/ml；(2) 取15 μl上述菌悬液于3 ml营养肉汤培养液中，充分混匀；(3) 在各浓度对应的药敏板相应孔位加入100 μl上述稀释菌液；(4)35 ℃静置培养18~20 h；(5) 孵育后，人工判读各株菌对多粘菌素B及E的最低抑菌浓度(MIC)。大肠埃希菌ATCC25922作为药敏试验质控菌株确保结果的可靠性。

若菌株对多粘菌素B的最小抑菌浓度≥8 μg/ml，则同时进行16种抗生素(氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸钾、萘啶酸、环丙沙星、氯霉素、链霉素、庆大霉素、阿奇霉素、头孢西丁、头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南、四环素、磺胺异恶唑、复方新诺明、强力霉素)的敏感性试验。药敏板购自上海星佰生物技术有限公司，实验步骤按照说明书进行。所得菌株MIC值，根据2016年美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的标准，获得相应敏感(S)、中度敏感(I)和耐药(R)结果。大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株确保药敏结果的可靠性。

采用热裂解法制备模板。挑取单个纯菌培养的新鲜菌落于100 μl纯水中，制成悬浊液。100 ℃煮沸10 min，冰浴10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清作为反应模板。-20 ℃保存以备用。

根据发表的mcr-1基因序列，设计引物进行mcr-1基因检测。mcr-1基因筛查引物序列：CST-partial-F：5′-CTT GGT CGG TCT GTA GGG-3′，CST-partial-R5′-CGG TCA GTC CGT TTG TTC-3′。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。PCR反应总体积为2 μl，其中2×Taq PCR MasterMix (TaKaRa公司)12.5 μl，mcr-1上下游引物(10 μmol/L)各200 pmol，DNA模板1 μl。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增结束后，将产物上样于1.0%的琼脂糖凝胶中，在0.5×TBE电泳缓冲液中进行电泳，记录PCR扩增结果。预期PCR产物长度为309 bp，对PCR阳性产物的样本进行mcr-1全基因扩增，并将扩增阳性的PCR产物送北京天一辉远生物科技有限公司进行序列测定，获得的mcr-1基因序列经比对后提交GenBank数据库，获得序列号。mcr-1全基因PCR扩增引物为：mcr1_F：5′-GCG GAT GAA TGC GGT GCG-3′，mcr1_R：5′-ATG ATG CAG CAT ACT TCT GTG-3′。mcr-1全基因扩增长度为1 623 bp，扩增条件与mcr-1基因筛查时的条件，除扩增循环中72 ℃延伸1.5 min外，其余均相同。每次实验均平行设立阴性对照(去离子水为模板)及阳性对照(含mcr-1基因的质粒DNA为模板)保证结果的准确性、可靠性。

参照国际实验室分子分型监测网络PulseNet中沙门菌PFGE分型标准化方案进行操作。简述如下：将细菌悬于细胞悬液(100 mmol/L Tris-HCl：100 mmol/L EDTA，pH 8.0) 中，调整浊度至5.0左右。吸取400 μl菌悬液加入20 μl蛋白酶K混匀，再加入400 μl低溶点琼脂(含1% SDS，56 ℃)混匀，灌制胶块。胶块加5 ml细胞裂解液(50 mmol/L Tris:50 mmol/L EDTA，pH 8.0，加1%十二烷基肌氨酸钠)和25 μl蛋白酶K (终浓度0.1 mg /ml)，54 ℃水浴摇床孵育2 h裂解细胞，然后用50 ℃预热的TE漂洗4次。切取2 mm胶块加入1 ml 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) 漂洗2次(每次15 min)，将胶块置于200 μl S1酶切缓冲液(50 mmol/L氯化钠, 30 mmol/L醋酸钠，5 mmol/L硫酸锌)中，加入1 U S1核酸酶(Sigma公司)，37 ℃酶切45 min^[7]。将酶切后的胶块进行PFGE(脉冲时间2.2~63.8 s，电泳19 h)。电泳完毕后，利用Del Dox 2000成像仪(Bio-Rad公司)获取经GelRed染色的凝胶图像。利用BioNumerics软件分析凝胶条带，并与DNA分子质量标准Marker进行比对，获得菌株内质粒大小情况。

以携带mcr-1基因的菌株为供体菌，大肠埃希菌J53作为受体菌，单菌落37 ℃活化过夜，次日以1 : 50的比例转接至新鲜5 ml LB中，37 ℃振荡培养至对数生长期A₆₀₀= 0.5~0.6，按1 : 1的比例在1.5 ml的离心管中混匀，低速离心集菌，弃上清。菌沉淀用新鲜LB洗2次后加200 μl LB重悬。将菌悬液加到0.45 μm滤膜上，37 ℃培养过夜。用1 ml LB将滤膜上的细菌洗下，离心沉淀，梯度稀释后分别涂布于含叠氮钠(100 μg/ml)的麦康凯培养基及同时含含叠氮钠(100 μg/ml)及多粘菌素B(2 μg/ml)双抗的麦康凯培养基上，37 ℃培养24 h。对长出的菌落分别进行计数，计算接合转移率(接合子数/受体菌数)。接合子为PCR扩增mcr-1阳性的大肠埃希菌。同时对这些接合子进行S1-PFGE分析，确定转移质粒大小。

运用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。用χ²检验进行率的比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

404株菌对多粘菌素B的MIC范围为≤0.125 μg/ml至 > 16 μg/ml，MIC₅₀为1 μg/ml，MIC₉₀为8 μg/ml。其中， < 4 μg/ml的共321株(79.46%)，≤4 μg/ml或 < 8 μg/ml的共360株(89.11%)，≥8 μg/ml的共44株(10.89%)，见图 3。

图 3 多粘菌素B及E对沙门菌的最低抑菌浓度分布 Figure 3 MIC distributions of polymyxin B and E for Salmonella

图选项

404株菌对多粘菌素E的MIC范围为≤ 0.125 μg/ml至 > 16 μg/ml，MIC₅₀为2 μg/ml，MIC₉₀为8 μg/ml。其中， < 4 μg/ml的共291株(72.03%)，≤4 μg/ml或 < 8 μg/ml的共340株(84.16%)，≥8 μg/ml的共64株(15.84%)，见图 3。

以8 μg/ml为判定耐药折点，实验菌株对多粘菌素B和E的耐药率分别为10.89%和15.84%。共13株菌株同时耐多粘菌素B及E，交叉耐药率为3.22%。

分离自食品的72株沙门菌，对多粘菌素B，MIC₅₀为0.5 μg/ml，MIC₉₀为 > 16 μg/ml。其中， < 4 μg/ml的共61株(84.72%)，≤4 μg/ml或 < 8 μg/ml的共63株(87.50%)，≥8 μg/ml的共9株(12.50%)，见表 1。

分离自患者粪便的204株沙门菌，对多粘菌素B，MIC₅₀为1 μg/ml，MIC₉₀为 > 16 μg/ml。其中， < 4 μg/ml的共132株(64.71%)，≤4 μg/ml或 < 8 μg/ml的共169株(82.84%)，≥8 μg/ml的共35株(17.16%)(表 1)。

分离自野生动物的128株沙门菌，对多粘菌素B，MIC₅₀为1 μg/ml，MIC₉₀为2 μg/ml。所有菌株对多粘菌素B的MIC值 < 4 μg/ml(表 1)。

以8 μg/ml为判定折点，食源性、人源性、动物源性沙门菌对多粘菌素B的耐药率分别为12.50%、17.16%和0.00%。不同来源沙门菌对多粘菌素B的耐药率差异有统计学意义(χ²=24.09，P < 0.01)。

分离自食品的72株沙门菌，对多粘菌素E，MIC₅₀为2 μg/ml，MIC₉₀为4 μg/ml。其中， < 4 μg/ml的共61株(84.72%)，≤4 μg/ml或 < 8 μg/ml的共66株(91.67%)，≥8 μg/ml的共6株(8.33%)(表 1)。

分离自人粪便的204株沙门菌，对多粘菌素E，MIC₅₀为2 μg/ml，MIC₉₀为8 μg/ml。其中， < 4 μg/ml的共137株(67.16%)，≤4 μg/ml或 < 8 μg/ml的共147株(72.06%)，≥8 μg/ml的共57株(27.94%)(表 1)。

分离自动物的128株沙门菌，对多粘菌素E，MIC₅₀为2 μg/ml，MIC₉₀为4 μg/ml。所有菌株对多粘菌素E的MIC值均≤8 μg/ml(表 1)。

以8 μg/ml为判定折点，食源性、人源性、动物源性沙门菌对多粘菌素E的耐药率分别为8.30%、27.94%和0.78%。不同来源沙门菌对多粘菌素E的耐药率差异有统计学意义(χ²=47.22，P < 0.01)。

对多粘菌素B≥8 μg/ml的菌株(食源9株，人源35株)同时进行16种抗生素的敏感性试验。结果表示，44株多粘菌素B≥8 μg/ml的沙门菌株除对亚胺培南全部敏感外，不同来源的沙门菌对各类抗生素均有不同程度的耐药，见表 2。食源性沙门菌对氨苄西林的耐药率最高(88.89%)，其次为阿奇霉素(55.66%)及萘啶酸、头孢西丁、四环素(均为44.44%)，对头孢吡肟的耐药率为11.11%。人源性沙门菌对萘啶酸耐药率最高(77.14%)，其次为链霉素(60.00%)、环丙沙星(45.71%)，对头孢吡肟的耐药率为8.75%。

44株多粘菌素B≥8的沙门菌中，仅有2株对多粘菌素E及16种抗生素均敏感(食源性沙门菌1株，人源性沙门菌1株)，其余均为多重耐药菌株。同时耐受多粘菌素及三代头孢的菌株有7株，其中食源性沙门菌2株(分别为鼠伤寒沙门菌及肠炎沙门菌)，人源性沙门菌5株(3株鼠伤寒沙门菌、1株汤普逊沙门菌、1株德尔卑沙门菌)。

对明确血清型的189株沙门菌进行分析，发现72株食源性沙门菌中，优势血清型为鼠伤寒沙门菌(S.Typhimurium，30.56%)及德尔卑(S.Derby，23.61%)；117株人源性沙门菌中，优势血清型为肠炎沙门菌(S.Enteritidis，22.22%)及鼠伤寒沙门菌(S.Typhimurium，20.51%)。食源性鼠伤寒沙门菌及德尔卑沙门菌对多粘菌素B的MIC值均集中在0.25~0.5 μg/ml，对多粘菌素E的MIC值均集中在1~2 μg/ml。人源性肠炎沙门菌对多粘菌素B的MIC值于4 μg/ml及 > 16 μg/ml处分布较多，对多粘菌素E的MIC值大多 > 4 μg/ml。人源性鼠伤寒沙门菌对多粘菌素B的MIC值均集中在1~2 μg/ml，其次为 > 16 μg/ml。而对多粘菌素E的MIC值于1 μg/ml处分布最多, 见表 3。

对404株沙门菌进行mcr-1 PCR检测，发现1株人源鼠伤寒沙门菌HLJ-Sa10131 mcr-1基因阳性，mcr-1基因总体携带率为0.25%，人源菌株携带率为0.49%。通过核酸BLAST比对，与已报道的mcr-1基因序列100%一致(基因号KY646314)。S1-PFGE结果显示，该菌株含有~80 kb、~120 kb、~250 kb大小3个质粒，见图 4。接合转移实验结果提示该菌株对多粘菌素的耐药性可以约4.50%的效率转移至受体菌E.coli J53中。接合子S1-PFGE显示可转移质粒大小为~ 240 kb(图 4)。综上所述及接合子mcr-1 PCR扩增阳性提示mcr-1基因位于大小为~240 kb的可转移质粒上。耐药表型结果显示：接合子对三代头孢菌素、多粘菌素B及E、氯霉素、链霉素、复方新诺明、庆大霉素等12种抗生素耐药，见表 4。

图 4 S1-PFGE图谱 Figure 4 S1-PFGE electrophoretogram 注：M:DNA Marker; 1:供体菌HLJ-Sa10131; 2:受体菌E.coli J53; 3~5:接合子1, 2, 3

图选项

目前，不同抗菌药物组织委员会对多粘菌素敏感性折点的判定值不同^[8]。沙门菌对多粘菌素B及E敏感性判定的标准目前尚无统一、明确的规定。SENTRY监测计划^[9]按照MIC≥2 μg/ml作为判定沙门菌对多粘菌素B耐药的流行病学标准。按照这一折点标准，本试验中，沙门菌对多粘菌素B的耐药率为30.45%(123/404)，略高于SENRY结果(24.00%)。根据本试验中沙门菌对多粘菌素B和E的MIC值分布特征，建议将多粘菌素B及E的临床耐药判定折点设为8 μg/ml(该折点尚需临床药物动力学数据的进一步验证)。按照这一判定标准，沙门菌对多粘菌素B和E的耐药率分别为10.89%和15.84%。且3种来源的沙门菌对多粘菌素B和E的耐药率存在差异，人源性沙门菌对多粘菌素的耐药率相对较高，提示应加强人源性耐药性沙门菌污染监测。

本研究表明多粘菌素B和E之间存在交叉耐药，对多粘菌素B耐药的细菌亦能通过同样的耐药机制对多粘菌素E耐药^[8]。绝大多数人源性与食源性沙门菌为多重耐药菌，发现多株同时耐受多粘菌素与三代头孢菌素的沙门菌株，但均对亚胺培南敏感，这与目前临床常将多粘菌素与碳青霉烯类联用的方案相一致^[10]。另外，多粘菌素耐药的沙门菌，其他测试的抗生素如头孢吡肟等，也存在敏感性，目前为止尚未检测到泛耐药沙门菌。发现相同来源，不同血清型沙门菌对多粘菌素的耐药性不同。另外，相同血清型，不同来源的沙门菌对多粘菌素的耐药性也不完全相同。沙门菌不同血清型对多粘菌素耐药表型差异的机制有待进一步研究。

最新研究发现，多粘菌素E的耐药性可通过携带mcr-1基因的质粒介导菌株间的水平转移^[4]。目前全球发现携带mcr-1基因的致病菌主要包括大肠埃希菌、沙门菌、肺炎克雷伯菌及宋内志贺菌^[11]，发现mcr-1阳性人源沙门菌血清型主要包括鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、乙型副伤寒菌沙门菌爪哇变种、维尔肖沙门菌等。本研究在404株沙门菌中，发现1株腹泻患者来源的鼠伤寒沙门菌mrc-1阳性，且该基因位于高水平可转移的质粒上，提示该耐药基因可能通过质粒水平转移引起播散。但接合子中的质粒大小与供体菌中质粒大小存在差异，提示该质粒在沙门菌内可能处于活跃的复制重组状态，造成质粒大小的差异，具体机制有待进一步研究。此外，接合子耐药表型提示该质粒同时携带产ESBL(Extended-Spectrum β-Lactamases，超广谱β-内酰胺酶)相关基因及氯霉素-链霉素-磺胺异恶唑-卡那霉素耐药基因，说明该质粒为多重耐药大质粒。这是国内报道人源产ESBLs沙门菌携带mcr-1基因。有关该耐药质粒的来源、遗传背景与已报道的携带mcr-1基因的其他质粒的关系正在研究中。除mcr-1基因介导多粘菌素E抗性外，发现鼠伤寒沙门菌对多粘菌素耐药主要是通过pmrAB及phoPQ二元调控系统发生突变，从而激活arnBCADTEF及pmrCAB操纵子，引起脂质A的修饰^[12]，导致菌株对多粘菌素耐受。mig-14基因亦参与其中^[13]。本研究中对多粘菌素耐药的绝大多数沙门菌株不携带mcr-1基因，其具体耐药机制是否由上述基因变异或其他耐药机制引起，尚待进一步研究。

总之，本研究发现我国人源产ESBLs鼠伤寒沙门菌携带可转移的mcr-1基因，且mcr-1基因与产ESBLs基因位于同一个可转移的多重耐药大质粒上。发现多种人源及食物源性沙门菌同时耐多粘菌素及三代头孢菌素。食品及野生动物中多粘菌素耐药菌株的发现，特别是在野生动物中发现多粘菌素E耐药菌株，提示应加强不同来源沙门菌的联合耐药监测、特别是可转移耐药基因及元件的检测及监测，控制耐药播散。

作者贡献:

曹阳  ORCID：0000-0002-0731-2555

曹阳：实验操作，数据分析，论文写作

遇晓杰：实验指导，数据分析

韩营营：实验操作

李杰：实验指导

阚飙：课题指导

闫梅英：实验设计与指导，论文指导与写作