2017, Vol. 32扩展功能
文章信息
- 阳波, 张网, 郭秋生, 白向宁, 许彦梅, 熊衍文, 罗成旺
- YANG Bo, ZHANG Wang, GUO Qiu-sheng, BAI Xiang-ning, XU Yan-mei, XIONG Yan-wen, LUO Cheng-wang
- 弥散黏附性大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及其在感染性腹泻患者中的流行情况
- Establishment of multiplex polymerase chain reaction assay for detection of diffuse adherent Escherichia coli in diarrhea patients
- 疾病监测, 2017, 32(5): 423-427
- Disease Surveillance, 2017, 32(5): 423-427
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.05.017
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文章历史
- 收稿日期：2016-11-17
2. 河南省睢县疾病预防控制中心, 河南 睢县 476900
2. Suixian County Center for Disease Control and Prevention, Suixian 476900, Henan, China
弥散黏附性大肠埃希菌(diffusely adherent E. coli，DAEC)是以弥散黏附方式黏附于HEp-2细胞表面的大肠埃希菌，可引起肠道感染、泌尿道感染等[1]。DAEC与5岁以下儿童水样腹泻密切相关，严重者可引起儿童持续血性腹泻CanKaoWenXian_4。常规的细菌选择性分离培养、生化鉴定等不能将DAEC与其他致泻性大肠埃希菌区别，而定义DAEC“弥散黏附”表型的细胞黏附实验与非典型肠致病性大肠埃希菌(atypical enteropathogenic E. coli，aEPEC)有交叉反应，特异性较差，且费时费力，难以在临床和基层实验室推广。大多数DAEC菌株含有Afa/Dr黏附素，表达该黏附素的操纵子包括afaA、afaB、afaC、afaD和afaE/daaE等多个基因[5]。随着分子生物学和生物信息学的发展，以核酸为基础的检测技术不断完善。本研究在总结单重PCR方法的文献和序列分析的基础上，选取afaB、afaC、afaD、daaE 4个黏附相关基因，并以16S rRNA基因rrs作为内参照基因设计引物，建立多重PCR方法，用于快速检测和鉴定DAEC，为感染性腹泻监测系统和临床检验提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 菌株及标本来源DAEC参考菌株DA07、DA60和DA119分离自人粪便标本，并由中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所新病原室鉴定保存。大肠埃希菌及其他肠道细菌对照菌株共229株，包括：肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E. coli，EPEC)(25株)、肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic E. coli，EHEC)(25株)、肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic E. coli，ETEC)(25株)、EAEC(aggR +)(53株)、肠侵袭性大肠埃希菌(enteroinvasive E. coli，EIEC)(25株)、尿道致病性大肠埃希菌(uropathogenic E. coli，UPEC)(1株)、非致泻性大肠埃希菌(4株)、福氏志贺菌(16株)、痢疾志贺菌(5株)、宋内志贺菌(4株)、鲍氏志贺菌(5株)、弗氏枸橼酸杆菌(4株)、小肠结肠炎耶尔森菌(4株)、甲型副伤寒沙门菌(1株)、猪霍乱沙门菌(1株)、肠炎沙门菌(1株)、肺炎克雷伯菌(1株)、运动克雷伯菌(1株)、普通变形杆菌(2株)、奇异变形杆菌(3株)、阴沟肠杆菌(1株)、粘质沙雷菌(1株)、摩氏摩根菌(1株)、类志贺邻单胞菌(1株)、粪肠球菌(4株)、屎肠球菌(3株)、铜绿假单胞菌(1株)、霍乱弧菌(3株)、副溶血性弧菌(1株)、鲍曼不动杆菌(1株)、单增李斯特菌(3株)、伊氏李斯特菌(3株)。389份腹泻患者粪便标本由河南省睢县CDC分别于2013年和2014年协助收集，标本收集后按1 : 1比例置30%甘油肉汤中-80 ℃低温保存备用。
1.2 试剂与仪器2 × Taq MasterMix及细菌基因组DNA提取试剂盒(BacteriaGen DNA Kit)购自北京康为世纪生物科技有限公司；科玛嘉ECC显色培养基购自法国CHROMagarTM公司；脑心浸液培养基购自北京陆桥技术有限公司；DL2000 DNA Marker购自日本TaKaRa公司；恒温振荡摇床为Grant OLS2000(英国Grant公司)；PCR仪LabCycler购自德国SensoQuest公司；凝胶成像系统Gel Doc XR购自美国Bio-Rad公司。
1.3 DNA模板制备实验菌株接种于脑心浸液平板培养18~24 h，挑取纯培养物于100 μl灭菌蒸馏水，100 ℃水浴10 min，14 000 r/min离心2 min，上清为水煮模板；细菌基因组DNA提取按照试剂盒操作步骤进行。
1.4 引物设计及合成以参考菌株DA07、DA60和DA119黏附相关基因簇(GenBank号分别为KR338832、KR338833及KR338831) 序列为参考，BLASTn比对并查找下载所有黏附相关基因序列后，Clustal W多序列比对各目的基因，选取序列保守区域，以在线Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)程序设计引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及扩增片段长度见表 1。
| 基因名称 | 引物序列(5′~3′) | 扩增片段长度(bp) | 参考文献 |
| afaB/C | F：CTG GGC AGC AAA CTG ATA ACT C | 792/793 | 本研究 |
| R：CAT CAA GCT GTT TGT TCG TCC G | |||
| afaD | F：TGA ACG GGA GTA TAA GGA AGA TG | 212 | [6] |
| R：GTC CAC CTG ACG CTC ATT CA | 本研究 | ||
| daaE | F：GAA CGT TGG TTA ATG TGG GGT AA | 542 | [7] |
| R：TAT TCA CCG GTC GGT TTA TCA GT | 本研究 | ||
| rrs | F：CCC CCT GGA CGA AGA CTG AC | 401 | [8] |
| R：ACC GCT GGC AAC AAA GGA TA |
分别以参考菌株DA07、DA60和DA119染色体为模板，扩增afaB/C、afaD、daaE及rrs基因片段。PCR体系(20 μl)：2 × Mix 10 μl，上下游引物分别为0.5 μmol/L，模板2 μl，蒸馏水6 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环，最后72 ℃再延伸7 min。取PCR扩增产物6 μl于1.5%琼脂糖凝胶，180 V电泳25 min后，凝胶成像系统下观察是否扩增出特异性条带。将PCR扩增产物送北京天一辉远生物科技有限公司测序，并与靶基因序列进行比对，以验证扩增产物的准确性。
1.6 多重PCR反应条件优化采用20 μl反应体系，分别以3株参考菌株染色体为模板，对影响多重PCR扩增效率的引物浓度(不同配比)、退火温度、循环次数等条件进行单因素优化。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，并与目的基因片段大小进行比较。
1.7 多重PCR特异性检测以参考菌株DA07、DA60和DA119作为阳性对照，应用优化后的PCR反应体系及条件，对其他致泻性大肠埃希菌及常见肠道病原菌进行引物特异性PCR扩增，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否有特异性扩增产物和产物大小。
1.8 多重PCR灵敏度检测参考菌株DA119接种于脑心浸液平板培养18~24 h，取1~3个菌落于5 ml脑心浸液液体培养基中，37 ℃恒温200 r/min振荡摇床培养，制备A600= 0.6的菌液，并于1 ×磷酸盐缓冲溶液中1 : 10稀释菌液，分别取10-5~10-7浓度菌液100 μl于脑心浸液平板，孵育箱37 ℃培养20 h后平板计数法进行菌落计数；分别取各浓度菌液100 μl制备50 μl的DNA模板溶液，各取2 μl进行PCR扩增和电泳检测，进行3次独立试验后，以每个反应可检出最低菌落形成单位为该体系的检测下限。
1.9 人粪便标本检测取适量腹泻患者粪便接种于科马嘉ECC平板，37 ℃培养18~24 h后，挑取10个白色或蓝色疑似大肠埃希菌菌落同时加入100 μl去离子水中，100 ℃煮沸10 min，经14 000 r/min离心2 min制备水煮模板，取2 μl上清以多重PCR方法进行初筛。afaB/C、afaD、daaE中任何一个基因出现扩增产物即判断为阳性标本。基因检测阴性标本再分别挑取10个可疑菌落。初筛阳性的菌落进一步接种于脑心浸液平板，再次进行多重PCR鉴定和系统生化鉴定。菌落PCR阳性并且生化符合大肠埃希菌即判断标本DAEC分离阳性。
2 结果 2.1 单重PCR验证引物及PCR产物测序结果分别以参考菌株DA07、DA60和DA119染色体为模板按上述PCR体系与条件扩增目的基因，3株参考菌株均能得到清晰特异条带，其中参考菌株DA07和DA60基因型为afaB/C + afaD，DA119基因型为afaB/C + afaD+ daaE，且内参照基因rrs扩增均为阳性。PCR扩增产物测序也与参考菌株相应序列一致。
2.2 多重PCR反应条件优化结果通过调整引物浓度和各引物配比、退火温度等，发现各引物对分别在浓度afaB/C 0.25 μmol/L、afaD 1.25 μmol/L、daaE 0.4 μmol/L、rrs 0.1 μmol/L条件下扩增产物条带较均一。确定最佳多重PCR体系为20 μl，包括2 × Mix 10 μl，DNA模板2 μl，4对上下游引物(浓度均为10 μmol)分别为afaB/C 0.5 μl，afaD 2.5 μl，daaE 0.8 μl，rrs 0.2 μl。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环，最后72 ℃再延伸7 min。
2.3 多重PCR特异性参考菌株DA07、DA60和DA119均能检测到相应特异性扩增片段，无非特异性扩增。除检测的53株EAEC中，1株afaB/C+afaD阳性，1株afaB/C阳性外，其他菌株均无非特异性扩增。部分样品的PCR扩增结果见图 1。
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| 图 1 参考菌株及其他肠道病原菌多重PCR检测结果 Figure 1 Multiplex PCR detection results of reference strains and other enteric pathogens 注：M：DL2000 DNA Marker; Lane 1~3：DAEC DA07菌株，DAEC DA60菌株，DAEC DA119菌株; Lane 4~16：EHEC EDL933，EPEC E2348/69，ETEC 10407，EAEC 042，EAEC EA022，EIEC 44825，鲍氏志贺菌，小肠结肠炎耶尔森菌，甲型副伤寒沙门菌，肺炎克雷伯菌，阴沟肠杆菌，粘质沙雷菌，铜绿假单胞菌 |
| |
多重PCR的4对引物检测效率不同，其中afaB/C、rrs基因的检测下限为3.20 × 101 CFU/反应(8.01 × 103 CFU/ml)，而afaD、daaE基因的检测下限为3.20 × 103 CFU/反应(8.01 × 105 CFU/ml)。
2.5 人粪便标本检测结果采用已建立的检测DAEC的多重PCR方法，对2013 2014年河南省睢县收集并低温保存的389份腹泻患者粪便进行DAEC的分离和鉴定，结果显示，DAEC菌株平均分离率为6.2%(24/389)，分离菌株表现为2种基因型，afaB/C + afaD和afaB/C + afaD + daaE。即afaB/C、afaD基因在所有分离的DAEC菌株中均可检测到，而只有1株菌株携带daaE基因。腹泻患者粪便标本DAEC分离结果见表 2。
| 年份 | 标本数(份) | afaB/C + afaD | afaB/C + afaD + daaE | ||
| 阳性菌株数 | 百分率(%) | 阳性菌株数 | 百分率(%) | ||
| 2013 | 131 | 14 | 10.69 | 0 | 0.00 |
| 2014 | 258 | 9 | 3.49 | 1 | 0.39 |
| 合计 | 389 | 23 | 5.91 | 1 | 0.26 |
24例携带DAEC菌株的腹泻患者以5岁以下儿童为主，占71%(17/24)，腹泻次数3~13次/d不等，部分患者可有发热，67%的患者出现腹痛，46%的患者表现为脓血便，见表 3。
| 菌株编号 | 分离时间(年-月-日) | 性别 | 年龄(岁) | 腹泻次数(次/d) | 发病时间(d) | 发热(℃) | 腹痛 | 粪便性状 | 抗生素使用 |
| 13-209 | 2013-08-15 | 女 | 44.0 | 5 | 2 | 38.0 | 有 | 稀便 | 头孢 |
| 13-226 | 2013－08－25 | 女 | 0.6 | 5 | 2 | - | 有 | 黏液便 | 庆大霉素 |
| 13-240 | 2013－08－31 | 女 | 1.6 | 9 | 1 | - | - | 水样便 | 无 |
| 13-251 | 2013－09－03 | 女 | 1.7 | 3 | 1 | - | 有 | 脓血便 | 无 |
| 13-328 | 2013－09－29 | 男 | 43.0 | 7 | 1 | - | - | 脓血便 | 无 |
| 13-329 | 2013－09－29 | 男 | 10.0 | 8 | 1 | 38.0 | 有 | 稀便 | 无 |
| 13-336 | 2013－10－01 | 男 | 0.6 | 8 | 1 | - | 有 | 脓血便 | 头孢 |
| 13-366 | 2013－10－13 | 男 | 24.0 | 6 | 1 | - | 有 | 米泔样 | 土霉素 |
| 13-378 | 2013－10－19 | 男 | 3.0 | 8 | 1 | 39.0 | 有 | 黏液便 | 无 |
| 13-343 | 2013－10－05 | 女 | 60.0 | 10 | 2 | - | 有 | 稀便 | 无 |
| 13-345 | 2013－10－06 | 女 | 0.5 | 3 | 1 | - | 有 | 脓血便 | 林可霉素 |
| 13-353 | 2013－10－09 | 男 | 1.1 | 3 | 1 | - | - | 脓血便 | 庆大霉素 |
| 13-377 | 2013－10－16 | 女 | 3.0 | 10 | 1 | 38.5 | 有 | 黏液便 | 庆大霉素 |
| 13-379 | 2013－10－19 | 男 | 1.5 | 3 | 1 | - | 有 | 脓血便 | 庆大霉素 |
| 14-99 | 2014－07－17 | 男 | 27.0 | 4 | 2 | - | 有 | 脓血便 | 青霉素 |
| 14-101 | 2014－07－17 | 男 | 1.6 | 8 | 2 | - | 有 | 脓血便 | 阿莫西林 |
| 14-114 | 2014－07－23 | 女 | 4.5 | 4 | 3 | 37.5 | 有 | 脓血便 | 氟哌酸 |
| 14-150 | 2014－08－18 | 女 | 0.6 | 9 | 2 | 37.5 | - | 脓血便 | 头孢 |
| 14-164 | 2014－08－31 | 女 | 0.7 | 4 | 4 | 37.6 | - | 黏液便 | 林可霉素 |
| 14-181 | 2014－09－10 | 男 | 1.8 | 5 | 1 | 37.5 | - | 黏液便 | 林可霉素 |
| 14-210 | 2014－09－27 | 男 | 52.0 | 9 | 1 | - | - | 黏液便 | 无 |
| 14-216 | 2014－10－02 | 女 | 2.5 | 8 | 4 | 39.0 | 有 | 脓血便 | 头孢 |
| 14-225 | 2014－10－09 | 男 | 1.9 | 13 | 2 | - | - | 脓便 | 林可霉素 |
| 14-246 | 2010－11－05 | 男 | 1.3 | 6 | 1 | 38.3 | 有 | 稀便 | 头孢 |
| 注：“-”为不发热或无腹痛。 | |||||||||
DAEC是重要的致泻性大肠埃希菌，主要引起18月龄至5岁儿童急性水样泻，连续感染可发展为迁延性腹泻，甚至引起儿童持续血性腹泻，带血症状持续长达1个月[2-4]。目前研究报道，DAEC可分离于猪、牛、家禽体内[1]，并且在奶酪、河水中也能分离到[9-11]，而世界各国腹泻儿童粪便中DAEC携带率较高[4,12-13]，存在暴发的可能性，因此有必要建立一种快速而有效的检测手段。DAEC的致病机制主要与afa/dra/daa操纵子编码的黏附素作用有关，操纵子包括afaF、afaA、afaB、afaC、afaD及afaE/daaE等多个基因，其中afaB/C、afaD基因相对保守，常单独作为检测DAEC的靶基因。而afaE变异相对较大。由于Afa/Dr黏附基因簇在不同来源特别是人和动物来源菌株间存在一定的序列变异，目前尚无有效的针对人源DEAC菌株的PCR检测方法。本研究在沿袭C1845的特异daaE基因认识的基础上，综合了保守基因afaB/C和afaD，同时内参照基因rrs的应用也可避免操作过程中造成的假阴性结果。腹泻样品的检测结果分析发现，含有daaE基因的菌株同时也含有afaB/C与daaD基因，且afaB/C与daaD基因在菌株中的存在情况完全一致，因此，必要时可只选择afaB/C或daaD基因来检测和鉴定DAEC。鉴于目前检测的标本数量有限，尚不能完全排除只有daaE基因，而afaB/C、afaD基因均阴性的情况；同样也不能排除afaB/C或afaD基因单独阳性的情况。因此以“afaB/C、afaD、daaE中任何一个基因出现扩增即判断为阳性标本”为判断标准，可以最大限度的避免因为Afa/Dr黏附基因簇序列变异而造成漏检。
本研究建立的多重PCR方法具有很好的特异性，除2株EAEC菌株外，对其他主要肠道致病菌无非特异性扩增。2株aggR阳性判断为EAEC的菌株，分别检测为afaB/C + afaD及afaB/C基因阳性，可认为这2株菌为同时含有EAEC和DAEC毒力基因的杂合菌。含有2种不同致病类型毒力基因的大肠埃希菌并不少见，如2011年德国大肠埃希菌O104 : H4暴发菌株，即是在EAEC菌株遗传背景(aggR阳性)基础上，获得了产志贺毒素2的噬菌体(stx2阳性)和ESBL耐药质粒[14]。
目前我国感染性腹泻监测系统和临床检验均缺乏鉴定DAEC快速而有效的方法，也缺乏DAEC在人群中的流行病学数据。本研究为临床腹泻标本的DAEC初步筛选和分离菌株的快速鉴定提供了技术支持，并且初步发现我国腹泻患者粪便标本DAEC的菌株分离率约为6%。菌株主要分离自5岁以下儿童，患者有腹痛和发热，粪便性质以脓血便居多，而脓血便是志贺菌引起的细菌性痢疾的重要特征。因这些样品尚未排除其他细菌性或病毒性病原的可能，DAEC的作用尚需要进一步明确。此外，DAEC在我国腹泻患者或健康者的流行病学分布规律、菌株的分子生物学特征及其公共卫生意义等仍需大量研究。
作者贡献:
阳波 ORCID：0000-0001-7964-1676
张网 ORCID：0000-0001-6036-113x
阳波、张网：开展实验、分析数据及文章撰写
郭秋生：样本收集
白向宁、许彦梅：实验指导和论文修改
熊衍文、罗成旺：课题设计、实验指导和论文修改
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