疾病监测  2017, Vol. 32 Issue (6): 467-471

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贺金荣, 朱雄, 李沙, 陈海, 吴华, 夏连续, 李伟, 郑霄
HE Jin-rong, ZHU Xiong, LI Sha, CHEN Hai, WU Hua, XIA Lian-xu, LI Wei, ZHENG Xiao
海南省类鼻疽临床分离株核糖体16S-23S内转录间隔区序列多态性分析
Genetic diversity of 16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer regions of Burkholderia pseudomallei strains isolated in Hainan
疾病监测, 2017, 32(6): 467-471
Disease Surveillance, 2017, 32(6): 467-471
10.3784/j.issn.1003-9961.2017.06.007

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收稿日期：2017-02-03
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贺金荣, 朱雄, 李沙, 陈海, 吴华, 夏连续, 李伟, 郑霄. 海南省类鼻疽临床分离株核糖体16S-23S内转录间隔区序列多态性分析[J]. 疾病监测, 2017, 32(6): 467-471.
HE Jin-rong, ZHU Xiong, LI Sha, CHEN Hai, WU Hua, XIA Lian-xu, LI Wei, ZHENG Xiao. Genetic diversity of 16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer regions of Burkholderia pseudomallei strains isolated in Hainan[J]. Disease Surveillance, 2017, 32(6): 467-471.
海南省类鼻疽临床分离株核糖体16S-23S内转录间隔区序列多态性分析
贺金荣1, 朱雄2, 李沙2, 陈海2, 吴华3, 夏连续1, 李伟1, 郑霄1    
1. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
2. 海南省三亚市人民医院, 海南 三亚 572000;
3. 海南省人民医院, 海南 海口 570311
收稿日期：2017-02-03
基金项目：国家自然科学基金（No.81573208）；海南省自然科学基金（No.814389）
作者简介：贺金荣, 北京市人, 主管技师, 主要从事传染病防治工作 朱雄, 男, 海南省三亚市人, 副主任检验师, 从事医学微生物检验工作
通信作者： 郑霄, Tel:010-61739444, E-mail:zhengxiao@icdc.cn.
摘要：目的 研究海南省类鼻疽伯克霍尔德菌核糖体16S-23S内转录间隔区（ITS）序列多态性及基因型特征，了解该省与其他类鼻疽流行区菌株间的遗传背景差异。方法 PCR扩增272株类鼻疽伯克菌的ITS片段并通过毛细管凝胶电泳检测产物长度；通过DNA测序及序列比对确认不同长度ITS的基因型及序列一致性；通过χ2检验分析不同流行区ITS型别的分布差异。结果 经毛细管凝胶电泳及DNA测序确认，272株类鼻疽伯克菌中发现C、E、CE、G 4种ITS基因型：C型64株（23.53%），E型144株（52.94%），CE型56株（20.59%），G型8株（2.94%）。序列比对证实，海南省类鼻疽伯克菌中各型别（C、E、G）ITS序列高度保守，不同型别ITS的长度变化由其主要变异区的序列差异引起。我国海南省与泰国流行区的ITS型别分布差异有统计学意义（χ2=8.296，P < 0.05），与澳大利亚流行区分布差异无统计学意义（χ2=5.521，P>0.05）。结论 海南省类鼻疽伯克菌临床菌株中存在C、E、CE、G 4种ITS基因型，C、E、CE为优势型别；与泰国、澳大利亚等传统流行区相比，其G型菌株比例较高。
关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌    16S-23S内转录间隔区    遗传学特征    
Genetic diversity of 16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer regions of Burkholderia pseudomallei strains isolated in Hainan
HE Jin-rong1, ZHU Xiong2, LI Sha2, CHEN Hai2, WU Hua3, XIA Lian-xu1, LI Wei1, ZHENG Xiao1    
1. State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, China CDC, Beijing 102206, China;
2. Sanya People's Hospital, Sanya 572000, Hainan, China;
3. Hainan Provincial People's Hospital, Haikou 570311, Hainan, China
This study were supported by the fund for the National Natural Science Foundation of China (No.81573208) and Natural Science Foundation of Hainan Province (No.814389)
Corresponding author: ZHENG Xiao, E-mail:zhengxiao@icdc.cn.
Abstract: Objective To investigate polymorphisms and genotypic characteristics of the 16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) regions of Burkholderia pseudomallei strains isolated in Hainan province and understand the difference in genetic background between B.pseudomallei strains of Hainan and other melioidosis-endemic areas worldwide. Methods ITS fragments of 272 B.pseudomallei strains from Hainan were amplified by PCR and the length of products were detected with capillary gel electrophoresis.Genotypes and sequence consistency of distinct lengths of ITSs were confirmed by DNA sequencing and alignment, and χ2 tests were used to evaluate the distributional difference of ITS types between Hainan strains and the strains from other melioidosis-endemic areas. Results By using the methods of capillary electrophoresis and DNA sequencing, we identified 4 genotypes of ITS (C, E, CE, G) among 272 strains of B.pseudomallei, including 64 strains of type C (23.53%), 144 strains of type E (52.94%), 56 strains of type CE (20.59%) and 8 strains of type G (2.94%).Sequence alignment showed that DNA sequences for each of three ITS types (C, E, G) in Hainan were conserved and that length difference between ITS types should be attributed to the sequential variations within the major region of variability of ITS.The difference in ITS genotype distributions were significant between Hainan strains and Thailand strains (χ2=8.296, P < 0.05), but no such significant difference was found between Hainan strains and Australia strains (χ2=5.521, P>0.05). Conclusion Four ITS genotypes (C, E, CE and G) were observed in B.pseudomallei strains of Hainan, among which C, E, CE were predominant.Compared with other melioidosis-endemic areas, such as Thailand and Australia, Hainan has a higher proportion of type G strains.
Key words: Burkholderia pseudomallei     16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer     Genetic characteristic    

核糖体16S-23S内转录间隔区(16S-23S ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer，ITS)是原核生物核糖体RNA操纵子(rrn)中16S rRNA、23S rRNA编码区之间的一段保守DNA序列，具有促进rRNA成熟及抑制转录终止等功能[1]。以往研究显示，一些致病菌的ITS序列多态性显著，可用于分子分型及系统进化研究[2-3]。类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei，类鼻疽伯克菌)是严重热带传染病类鼻疽的病原菌，其基因组中共含有4个RNA操纵子，各自分别带有一个ITS序列[4]。Liguori等[4]通过毛细管电泳及测序等方法研究了世界各流行区共1 191株类鼻疽伯克菌的ITS序列，发现存在C、E、CE、G、GC、GE等ITS基因型，C、E、CE等型主要分布于东南亚、澳大利亚等类鼻疽传统高发区；G型菌株则多见于非洲、中美洲等散发流行区。因此，类鼻疽伯克菌的ITS型别特征与其地理来源密切相关，对于认识不同流行区菌株的种群特点、来源及传播历史等具有重要意义。

海南省是我国主要的类鼻疽流行区之一，但目前对该地区类鼻疽病原菌的分子遗传特征、来源等诸多方面尚缺乏了解。为此，本研究采用毛细管电泳及DNA序列分析等方法对海南类鼻疽伯克菌的ITS多态性特征进行了初步分析，证实C、E、CE为其主要ITS型，并且存在G型菌株，为探明海南省类鼻疽伯克菌的遗传学背景、历史来源、活动特点等提供了分子依据。

1 材料与方法1.1 菌株来源及核酸提取

2011—2015年在海南省开展类鼻疽病原监测过程中收集的类鼻疽伯克菌共272株，其中临床菌株269株，分离自类鼻疽患者，相关患者分布于海南省除琼中县以外的17个市(县)；环境菌株3株，分离自2014年三亚市郊水井水。所有菌株均经细菌学及分子诊断确认。核酸提取：使用基因组提取试剂盒(DNeasy Blood & Tissue Kit，Qiagen公司)于生物安全实验室提取菌株染色体DNA，操作步骤详见说明书。DNA经无菌验证后置-20 ℃保藏备用。

1.2 毛细管凝胶电泳

参照文献中的方法[4]，PCR扩增ITS目标片段并通过毛细管凝胶电泳检测产物长度。扩增引物：GTW_For_FAM (5′-FAM/GTG AAG TCG TAA CAA GGT AGC CGT-3′)，GTW_Rev (5′-AAG GCA TCC ACC ACA TGC ACT T-3′)；引物序列分别位于16S rDNA及23S rDNA保守区内，上游引物用FAM荧光标记。PCR采用LA Taq with GC Buffer试剂(大连TaKaRa公司)，反应体系参见说明书，扩增条件为：95 ℃预变性7 min，然后以94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，扩增30个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物送北京天一辉远生物技术有限公司进行毛细管电泳检测，所用测序仪为PRISM 3730XL(美国ABI公司)，根据GeneScan 1200 LIZ DNA Marker(美国ABI公司)确定产物长度，软件为GenMapper 4.0。

1.3 DNA测序与序列分析

自不同长度ITS的纯合菌株中每组各选取3株菌进行ITS序列测定，与已公布的ITS参考序列(表 1)比对，确定其型别。ITS扩增及测序引物为GTW_For和GTW_Rev，无荧光标记。PCR扩增体系及条件同上，产物送北京天一辉远生物技术有限公司双向测序。C、E、G型ITS参考序列自GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)数据库下载，序列校对及比对通过Mega 6.0软件完成[5]。

表 1 272株海南类鼻疽伯克菌ITS的毛细管电泳检测结果、对应型别及参考序列 Table 1 Product length (capillary electrophoresis method), corresponding genotypes and reference sequences for ITSs of 272 B. pseudomallei strains from Hainan
ITS扩增产物长度(bp)菌株数(n)百分比(%)型别参考序列[4](长度bp)
684~68682.94GFJ981720, FJ981721 (613)
690~6996423.53CFJ981716, FJ981717 (622)
722~73114452.94EFJ981706, FJ981707 (661)
692~698, 725~7335620.59CEFJ981716, FJ981706 (622, 661)
表选项
1.4 统计学分析

采用χ2检验，比较海南省与泰国、澳大利亚等类鼻疽流行区的ITS型别分布是否一致，统计分析软件为SPSS 19.0。P < 0.05时组间差异有统计学意义。

2 结果2.1 毛细管电泳检测

272株海南类鼻疽伯克菌的ITS毛细管电泳检测结果见表 1。单一条带的ITS纯合型菌株共216株，根据长度分为3组：684~686 bp(8株)、690~699 bp(64株)、722~731 bp(144株)；排除两端的16S rDNA及23S rDNA保守序列(共72 bp)，检测的ITS长度分别与G、C、E型参考序列长度一致(表 1)。双条带的ITS杂合型菌株56株，2条带长度分别为692~698 bp及725~733 bp，与CE型ITS参考序列的长度一致。

2.2 ITS序列比对及基因型判定

以往研究证实[4]，类鼻疽伯克菌的ITS序列相对保守，导致C、E、G 3种类型ITS长度差异的区域(主要变异区)位于3′端(595~643 bp，E型)，见图 1A。本研究中，DNA序列比对显示海南省3类ITS序列与其他流行区的ITS参考序列基本一致，仅个别碱基发生替换(同源性99.20%~100.00%)；序列比对结果见图 1B：684~686 bp组(菌株HK081、SY166、SY175) 的ITS序列与G型参考序列(FJ981720、FJ981721) 匹配；690~699 bp组(HK081、SY166、SY175) ITS序列与C型参考序列(FJ981716、FJ981717) 匹配；722~731 bp组(HK081、SY166、SY175) ITS序列与E型参考序列(FJ981706、FJ981707) 匹配。以上结果提示，各型别ITS序列均高度保守；组内ITS长度变化可能由毛细管电泳检测的误差引起，组间ITS长度差异由变异区的序列差异引起，与以往研究一致[4]。

图 1 海南省与其他流行区类鼻疽伯克菌代表株的ITS序列比对结果 Figure 1 Alignment of 16S-23S rDNA ITS sequences between B. pseudomallei strains of Hainan and other melioidosis-endemic areas 注：A显示ITS及其主要变异区在基因组中的相对位置；B显示海南地区不同长度ITS与已公布的ITS参考序列(表 1)在DNA水平具有一致性
图选项
2.3 海南省类鼻疽伯克菌的ITS型别分布

基于ITS序列保守性、毛细管电泳检测及序列比对结果，确定本次研究的类鼻疽伯克菌含有C、E、CE、G 4种ITS型，对应菌株数分别为64株(23.53%)、144株(52.94%)、56株(20.59%)和8株(2.94%)，以C、E、CE为主，未发现GC及GE杂合型菌株(表 1)。海南省G型菌株比例高于泰国、澳大利亚等流行区，见图 2。4种基因型分布(所占百分比)的χ2检验表明，海南省与泰国流行区的ITS分布差异有统计学意义(χ2=8.296，P < 0.05)，而与澳大利亚流行区的差异不显著(χ2=5.521，P>0.05)。

图 2 海南省类鼻疽伯克菌4种ITS型的分布及与澳大利亚、泰国等流行区的比较 Figure 2 Distribution of four ITS types of B. pseudomallei in Hainan and comparison with that in Australia and Thailand 注：a海南省与泰国ITS型别分布差异有统计学意义(χ2=8.296，P < 0.05)
图选项
3 讨论

根据地理分布及流行强度不同，全球已知的类鼻疽疫源地可分为两类：一类是以泰国、马来半岛及澳大利亚北部等为代表的传统高发流行区；另一类是非洲、美洲等局部地区发现的散发流行区[6-7]。分子分型及基因组学研究表明，高发流行区的类鼻疽伯克菌遗传多态性明显，其ITS序列以C、E、CE型为主(99.22%)，G型仅占0.78%；散发流行区的类鼻疽分离株分子型别相对单一，G型为其ITS优势型别(88.89%)。目前，ITS型别地理分布差异的原因尚不清楚。一方面与地理分隔有关，另一方面此种分化可能有其遗传和生物学原因。ITS为16S-23S核糖体操纵子中的非编码序列，但具有促进rRNA成熟等重要生物学功能[1]。类鼻疽伯克菌ITS的差异可能赋予相应菌株不同的生理功能和适应能力。因此，ITS的多态性变异及地理分布差异可能反映了类鼻疽伯克菌对于生存环境的适应性改变。本研究表明，海南省类鼻疽伯克菌的ITS以C、E、CE型为主(97.06%)，与泰国、澳大利亚的ITS型别特征相近，也与海南省所处的地理位置临近上述地区相符。海南省G型菌株所占比例(2.94%)高于泰国、澳大利亚等流行区(0.78%)，其来源及是否与非洲、美洲菌株存在关联等问题尚待研究。

两大流行区ITS基因型的主要差异是泰国CE杂合型菌株比例(38.50%)远高于澳大利亚(14.50%)[4]。类鼻疽伯克菌的菌株间DNA重组是形成杂合型菌株的主要原因，泰国流行区CE比例高可能与当地环境中类鼻疽伯克菌阳性率高、菌株间ITS重组更频繁有关。本研究中海南省CE型杂合菌株比例(20.59%)稍高于澳大利亚，但远低于泰国流行区，说明海南省鼻疽伯克菌的菌株间重组率尚不高，与近期疫源地调查中海南省类鼻疽伯克菌的环境分离率相对较低相符[8]。

基于核糖体操纵子(rrn)DNA序列多态性的核糖体分型(Ribo-typing)是较早出现的细菌分子分型技术，在流行病学调查和病原溯源中已有广泛应用[9]。但是，由于核糖体序列本身高度保守，导致此类方法分辨能力较弱。本研究的272株类鼻疽伯克菌仅对应4种ITS基因型，说明大量菌株仅靠ITS型别难以区分，局限性明显。然而，鉴于高分辨力的类鼻疽伯克菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)[10]、多位点序列分型(MLST)[11]、多位点可变数目串联重复序列多态性分析(MLVA)[12]等分子分型技术均已建立并广泛应用，菌株间的区分与比对已不再是难题。与上述分型方法相比，ITS分型的特殊之处在于菌株的ITS型与地理分布存在相关性，对于菌株来源具有指示意义，并可用于大尺度的菌株遗传特征比较研究中[7]。此外，该方法通过毛细管电泳检测扩增片段的长度即可判定ITS型别，无需进行测序验证，较PFGE、MLST等分型方法更加简便快速[9]。因此，鉴于ITS型具有较好的流行病学意义，并且筛查易于实施，可将此分子标识用于类鼻疽的流行病学调查和病原学监测工作中。

作者贡献:

贺金荣ORCID：0000-0002-4276-2754

朱雄ORCID：0000-0002-2594-875X

贺金荣、朱雄、李沙、郑霄：实验操作、数据分析、论文撰写等

陈海、吴华：菌株分离及保藏

夏连续、李伟：技术指导

参考文献
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