恙虫病(tsutsugamushi disease)又称丛林斑疹伤寒(scrub typhus)，是由携带恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi，Ot；原称恙虫病立克次体，Rickettsial tsutsugamushi)的恙螨幼虫叮咬而传播的一种自然疫源性疾病^[1-2]。其传染源主要为鼠类。主要表现为突发高热、虫咬处溃疡或焦痂、淋巴结肿大、皮疹以及多器官损害，严重者可致死亡^[2-3]。该病广泛流行于亚太地区^[4]，我国较为严重，特别是近些年我国流行范围不断扩大，病例数呈现上升趋势^[5-6]。云南省为恙虫病流行的主要省份，近年该病病例数较多，然而云南省有关恙虫病更多的流行情况还停留于20世纪的调查资料^[7-8]。为进一步提高对本病的认识，笔者在全省范围内对2010—2013年各医疗机构送检的不明原因发热患者进行了实验室检测与分析，结果如下。

2010—2013年收集到各医疗机构送检的患者(不明原因发热≥4 d，体温≥38 ℃，1~3周内到过野外，用抗生素后无明显好转)血液标本79份，分离出的血清用于抗体检测，血块用于核酸提取，并收集病例资料。根据恙虫病预防控制技术指南^[9]，结合患者临床发病情况和实验室检测结果进行综合分析，IFA检测Ot IgG抗体效价≥1:64的患者为临床诊断病例，而IgG抗体效价≥1:256和核酸检测阳性为实验室确诊病例。

DNA提取试剂盒(Qiagen公司)、GoTaqGreen Master(2×)试剂盒(Promega公司)、Ot抗原片(Scimedx公司)、荧光素标记的羊抗人IgG抗体(KPL公司)、DNA Marker DL 2000(大连宝生物公司)、荧光显微镜(Nikon公司)、PCR仪(Biometra TProfessional)。

用PBS从1:16开始对被检样本血清作系列稀释至1:1 024，将各稀释度血清、阴性对照、阳性对照分别加到Ot抗原片孔内，放入湿盒置37 ℃孵育45 min，用PBS洗片3次，每次1~2 min，吹干，加入荧光素标记的羊抗人IgG抗体，放入湿盒置37 ℃孵育30 min，用PBS洗片3次，每次1~2 min，吹干，荧光显微镜下观察结果。荧光明亮，呈黄绿色，病原体均匀分布，即可判定该滴度为阳性。

用研磨器研磨血块，取100 μl样品用DNA提取试剂盒提取总DNA，应用文献[10]中的引物及条件对Ot sta56基因进行扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应总体积为25 μl，应用GoTaqGreen Master Mix(2×)试剂盒进行2次PCR扩增，以无菌水作为阴性对照。第1次扩增时取5 μl被检标本DNA为模板，第2次扩增时取第1次扩增产物1 μl作为模板。取2次PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶检测，DNA标准为DL 2000，加样量5 μl/孔，扩增目的片段481~507 bp。

PCR阳性产物送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。将所得到的序列通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)站点后，利用BLAST工具以及采用DNAstar中的MegAlign软件对序列进行同源性比较，运用Mega 6.06软件Neighbor-joinjing法(Bootstrap值设定为1 000) 构建系统进化树。

2010—2013年共收集79份病例资料，均有发热，体温在38~41 ℃，呈弛张热型，持续或不间断发热4~26 d，有全身酸痛或乏力者34例、肝脾肿大者6例，有些病例还伴有畏寒、寒战、食欲减退、结膜充血、皮疹、咳嗽、咳痰、尿少等；焦痂或溃疡者9例，其中左腋窝2例、右腋窝2例、腰部1例、左膝窝1例、右膝窝1例、前胸1例、眼睑1例。2010—2013年病例数分别为17、14、33和15例。农民55例、学生10例、其他和职业不详14例。男女性别比为1.08:1，年龄在8~71岁。发病于夏秋季的有48例、冬春季的有31例。患者患病前1~3周均有田间劳作或野外活动史，一些居民区可见鼠类活动。患者均给予青霉素类或头孢菌素类抗生素等治疗无好转。

对79例发热患者分别进行IFA Ot IgG抗体和PCR Ot sta56基因检测，结果抗体效价≥1:64的有38份，阳性率48.10%；sta56基因检测阳性3份(样本11-6、12-9和12-17)，阳性率3.80%，见表 1。

在79例发热患者中，恙虫病患者38例，临床特征见表 2。其中实验室确诊病例18例(17例IgG抗体效价≥1:256和1例核酸阳性)，临床诊断病例20例。38例恙虫病患者中，滇西地区(大理市31例、保山市1例)占84.21%、滇中地区(楚雄市2例、昆明市1例)占7.89%、滇南地区(普洱市1例)占2.63%、不详2例。全年均有发病，以夏秋季为主(29例)，占76.32%，其中8月最多(10例)，占26.32%。男女性别比为0.81:1(17/21)。农民27例，占71.05%；学生4例，占10.53%，其他7例，占18.42%。0~14岁儿童占7.89%，15~64岁青壮年占86.84%，≥65岁老年人占5.26%。

根据Ot sta56基因部分序列应用MegAlign软件将测序获得的样本序列(465 bp)与GenBank中已知参考菌株序列进行同源性比较，结果序列12-17、11-6和12-9株的同源性在94.3%~99.8%。序列11-6与中国台湾KM05、TW45R株的同源性最高均为100%，与Karp株的同源性93.2%，与Boryong株的同源性92.2%，与中国Neimeng-65株的同源性79.1%，与Kato株的同源性74.2%。序列12-9与中国台湾KM05、TW45R株的同源性最高均为99.8%，与Karp株的同源性93.0%，与Boryong株的同源性92.0%，与中国Neimeng-65株的同源性78.9%，与Kato株的同源性74.0%。序列12-17与日本O3株和中国台湾OI06-2、OI07、MZ01-1的同源性最高均为99.8%，与Karp株的同源性97.5%，与Boryong株的同源性91.8%，与中国Neimeng-65株的同源性79.1%，与Kato株的同源性72.7%。

根据Ot sta56基因部分序列(465 bp)进行系统进化树分析，结果样本12-9和11-6序列与中国台湾KM05、TW45R等株均在同一分支上，表明本次检测到的12-9和11-6 Ot株与部分中国台湾Ot株的遗传进化关系较为密切；而12-17序列与日本O3株在同一个分支上，表明Ot 12-17株与日本O3株的遗传进化关系较为密切，见图 1。

图 1 根据Ot sta56基因部分序列构建的系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree of partial segments of Ot sta56 gene sequence

图选项

云南为我国西南边陲高原山区省份，与缅甸、老挝、越南接壤，地理环境复杂多样，以热带和亚热带气候为主，存在恙虫病、斑疹伤寒、斑点热等多种立克次体疾病^{[6, 11-12]}。近年来，云南省多次出现立克次体病暴发疫情，2002年昆明市东川区暴发恙虫病^[13]、2004年大理州暴发鼠型斑疹伤寒^[14]、2005年大理州暴发恙虫病^[15]、2009年保山地区暴发鼠型斑疹伤寒^[11]、2010年瑞丽地区暴发鼠型斑疹伤寒^[16]、2013年峨山地区暴发恙虫病并出现死亡病例^[17]。目前，云南省恙虫病的调查与研究相对较少，而更多的仅停留在少数病例资料的报道上。

本文对云南省2010—2013年不明原因发热患者进行了恙虫病调查，结果显示恙虫病感染率较高(48.10%)，有特异性焦痂或溃疡的恙虫病患者较少，仅占23.68%。流行病学分析表明，恙虫病病例主要分布于滇西地区，夏秋季高发，以农民为主，青壮年居多，与以往流行情况基本一致^[7-8]。基因进化树分析显示，本次检测到的12-9和11-6(样品编号)序列与部分中国台湾Ot株的进化关系较为密切，12-17序列与日本O3株的进化关系较为密切，表明Ot抗原型别呈现多样性特点。检测到的3株Ot均为Karp基因型，但它们并非来源于同一地区，其进化来源可能较为复杂。

云南省恙虫病患者的临床表现多数不典型。目前，恙虫病的诊断均是通过临床表现或/和非特异性的外斐试验进行回顾性诊断，漏诊、误诊十分严重。云南省为我国旅游胜地，自然环境复杂，物种丰富，鼠类和恙螨繁多。随着该省资源开发及生态环境改变，尤其是旅游业的发展，该病已成为一个重要的公共卫生问题。应加强恙虫病的监测和防控工作，尤其应加强诊断能力的建设。

作者贡献:

ORCID：0000-0002-9917-9420

亚红祥：样本和资料的收集、实验室工作、数据的分析

张云智：资料的收集、分析、指导