疾病监测  2017, Vol. 32 Issue (7): 609-614

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亚红祥, 沈姝, 苏正元, 邓菲, 张云智
YA Hong-xiang, SHEN Shu, SU Zheng-yuan, DENG Fei, ZHANG Yun-zhi
云南省西北地区家畜体表蜱类形态学与分子生物学鉴定
Morphological and molecular identification of tick species from body surface of domestic animals in northwestern Yunnan
疾病监测, 2017, 32(7): 609-614
Disease Surveillance, 2017, 32(7): 609-614
10.3784/j.issn.1003-9961.2017.07.019

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收稿日期：2016-12-14
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亚红祥, 沈姝, 苏正元, 邓菲, 张云智. 云南省西北地区家畜体表蜱类形态学与分子生物学鉴定[J]. 疾病监测, 2017, 32(7): 609-614.
YA Hong-xiang, SHEN Shu, SU Zheng-yuan, DENG Fei, ZHANG Yun-zhi. Morphological and molecular identification of tick species from body surface of domestic animals in northwestern Yunnan[J]. Disease Surveillance, 2017, 32(7): 609-614.
云南省西北地区家畜体表蜱类形态学与分子生物学鉴定
亚红祥1, 沈姝2, 苏正元2, 邓菲2, 张云智1     
1. 云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室, 云南 大理 671000;
2. 中国科学院武汉病毒研究所, 湖北 武汉 430071
收稿日期：2016-12-14
基金项目：国家自然科学基金（No.81060132，No.81260437）；科技基础性工作专项重点项目（No.2013FY113500）；传染病预防控制国家重点实验室基金（No.2013SKLID302）
作者简介：亚红祥, 男, 云南省陆良县人, 副主任医师, 硕士, 主要从事立克次体病等自然疫源性疾病相关的防控工作.
通信作者：张云智, Tel:0872-2196147, Email:zhangyunzhi18184@163.com.
摘要：目的 调查云南省西北地区家畜体表蜱的种类及其种群遗传进化情况。方法 采集家畜体表寄生的蜱虫，经形态学鉴定后，用PCR法扩增蜱样本的16S rDNA和ITS2基因片段，测序后进行序列分析。结果 共采集成蜱样本1 275只，经形态学鉴定为1科3属4种，其中微小扇头蜱1 263只（占99.1%），卵形硬蜱7只（占0.6%），锐跗硬蜱4只（占0.3%），未知血蜱1只（占0.1%）。样品分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致。16S rDNA序列分析显示，蜱P6与印度微小扇头蜱（EU918188）的相似性最高为99.8%，与中国云南微小扇头蜱（JX051062）的相似性99.4%；蜱P2与美国卵形硬蜱（U95900）的相似性最高为93.8%；蜱P1与日本锐跗硬蜱（AB105167）的相似性最高为95.9%；蜱P4与澳大利亚parva血蜱（JX573136）的相似性为90.5%，与中国云南长角血蜱（JX051064）的相似性为88.7%。ITS2序列分析显示，蜱P6与来自老挝（KC503276）、中国云南（KC203364）的微小扇头蜱的相似性均为99.9%；蜱P2与日本卵形硬蜱（D88857）的相似性最高为96.1%；蜱P1与日本锐跗硬蜱（AB605168）的相似性最高为95.3%；蜱P4与罗马尼亚Haemaphysalis parva血蜱（FN296282）的相似性最高为91.0%。结论 云南地区家畜体表存在微小扇头蜱、卵形硬蜱、锐跗硬蜱和一种与parva血蜱相关的新型血蜱。
关键词：蜱虫    鉴定    PCR检测    序列分析    
Morphological and molecular identification of tick species from body surface of domestic animals in northwestern Yunnan
YA Hong-xiang1, SHEN Shu2, SU Zheng-yuan2, DENG Fei2, ZHANG Yun-zhi1     
1. Yunnan Institute of Endemic Diseases Control and Prevention/Yunnan Provincial Key Laboratory of Natural Focal Disease Control and Prevention, Dali 671000, Yunnan, China;
2. Wuhan Institute of Virology, China Academy of Science, Wuhan 430071, Hubei, China
This study were supported by the found for National Natural Science Foundation of China (No.81060132, No.81260437), the Scientific and Technological Basis Special Project from the Minister of Science and Technology of the People′s Republic of China (No.2013FY113500), and the Project of State Key Laboratory for Infectious Diseases Prevention and Control (No.2013SKLID302)
Corresponding author: ZHANG Yun-zhi, Email:zhangyunzhi18184@163.com.
Abstract: Objective To investigate the species composition and genetic variants of ticks in the northwest area of Yunnan province. Methods The collected ticks from the body surface of domestic animals were identified morphologically. The 16S rDNA and ITS2 segments of ticks were amplified respectively by PCR and sequenced. The homologies of the above segments with other known sequences were analyzed. Results A total of 1 275 ticks were collected from the body surface of domestic animals and classified into four species of three genus of one family by species morphological identification. Of them, 1 263 (99.1%) were Rhipicephalus microplus, 7 (0.6%) were Ixodes ovatus, 4 (0.3%) were Ixodes acutitarsus and 1 (0.1%) were Haemaphysalis sp. Molecular detection confirmed the results of the morphological identification. Sequence analysis showed that 16S rDNA fragments of tick P6 shared highest homology (99.8%) with Rhipicephalus microplus (EU918188) from India, and 99.4% homology with Rhipicephalus microplus (JX051062) from Yunnan of China. 16S rDNA fragments of tick P2's shared highest homology (93.8%) with Ixodes ovatus (U95900) from USA. Tick P1's 16S rDNA fragments shared highest homology (95.9%) with Ixodes acutitarsus (AB105167) from Japan. Tick P4's 16S rDNA fragments shared highest homology (90.5%) with Haemaphysalis parva (JX573136) from Australia, and 88.7% homology with Haemaphysalis longicornis (JX051064) from Yunnan of China. Tick P6's ITS2 fragments shared highest homology (99.9%) with Rhipicephalus microplus from Laos (KC503276) and Yunnan of China (KC203364). Tick P2's ITS2 fragments shared highest homology (96.1%) with Ixodes ovatus (D88857) from Japan. Tick P1' ITS2 fragments shared highest homology (95.3%) with Ixodes acutitarsus (AB605168) from Japan. Tick P4's ITS2 fragments shared highest homology (91.0%) with Haemaphysalis parva(FN296282) from Romania. Conclusion Rhipicephalus microplus, Ixodes ovatus, Ixodes acutitarsus and a new Haemaphysalis sp. which is related to Haemaphysalis parva, were detected on the body surface of domestic animal in Yunnan province.
Key words: Tick     Identification     PCR detection     Gene sequence analysis    

蜱是一种寄生于动物体表的常见的吸血寄生虫，隶属节肢动物门(Arthropoda)，蛛形纲(Arachnida)，蜱螨亚纲(Acari)，寄螨总目(Parasitiformes)，蜱目(Ixodida)。目前世界上已发现硬蜱科(Ixodidae)12属713种，软蜱科(Argasidae)4属185种，纳蜱科(Nuttalliellidae)1属1种，共计3科17属899种[1]。中国发现蜱类2科(硬蜱科和软蜱科)10属119种[2]。蜱可携带细菌、病毒、立克次体、寄生虫等病原体叮咬人或动物，引发多种人兽共患疾病[3]。自2006年安徽省首次发现人粒细胞无形体病以来，我国各地报道了许多“蜱叮人”事件，涌现出大量蜱传病例，并发现了新布尼亚病毒、新内罗病毒、劳氏立克次体等新的蜱传病原体与疾病[4-8]。蜱已是我国近年来重要的新发传染病的主要传播媒介之一。云南省为我国西南边陲高原省份，素有“动植物王国”之称，已发现蜱类47种居我国首位[9-10]，存在莱姆病、Q热、森林脑炎、巴贝西虫病等多种蜱传疾病[11]，但对其媒介蜱的相关调查较少[12]。云南省西北地区山多，地形复杂，动植物丰富，自然条件优越，较适宜宿主动物及媒介昆虫的生存与繁殖。为了更好地认识媒介蜱，为蜱的防治和蜱传播疾病的研究提供依据，笔者在云南省西北地区进行了蜱类及蜱携带病原体的调查。

1 材料与方法 1.1 样本来源

2015年4月在云南省怒江州和迪庆州家养动物体表分别采集蜱1 227只和37只，8月在云南省德宏州瑞丽市家养动物体表采集蜱11只，置液氮保存。

1.2 形态学鉴定

参考文献[13]分类检索表中的描述，在体视显微镜(SMZ-45T3，重光仪器有限公司)下直接观察进行蜱形态学鉴定。

1.3 PCR检测

以生理盐水作为研磨液将经形态学鉴定后的蜱种分别进行研磨，每份样品取60 μl研磨悬液，采用Qiagen公司的组织DNA提取试剂盒，按说明书操作提取总DNA。应用文献[14-15]中的引物及条件对样品的16S rRNA和ITS2基因分别进行聚合酶链反应(PCR)扩增，目的基因片段分别为460 bp和920~1 850 bp，引物由武汉擎科生物科技有限公司合成。PCR反应总体积为50 μl，应用北京全式金生物技术有限公司2×EasyTaq PCR SuperMix试剂盒在Biometra TProfessional PCR仪中进行PCR扩增，以无菌水作为阴性对照，无阳性对照。PCR扩增时取2 μl被检样本DNA为模板，6 μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶检测，DL5000 DNA Marker来自于大连宝生物公司。

1.4 DNA序列测定及分析

PCR阳性产物送武汉擎科生物科技有限公司进行序列测定。利用SeqMan软件拼接序列后，通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)利用“BLAST”工具进行比较得到相关的已知序列信息。然后，采用DNAstar中的MegAlign软件对序列进行同源性比较，并运用Mega 6.06软件Neighbor-joining法(Kimura 2-parameter model)自展1 000次构建系统进化树。

2 结果 2.1 形态学鉴定

通过观察蜱假头基、基突、须肢、眼、盾板、缘垛、气门板、足、肛沟等形态学特征，见表 1。将1 275只成蜱鉴定为1科(硬蜱科)3属(扇头蜱属Rhipicephalus、硬蜱属Ixodes、血蜱属Haemaphysalis)4种，见图 1。其中微小扇头蜱(R. microplus)1 263只(占99.1%)，卵形硬蜱(I. ovatus)7只(占0.6%)，锐跗硬蜱(I. acutitarsus)4只(占0.3%)，未知血蜱(Haemaphysalis sp.)1只(占0.1%)。

表 1 云南省西北地区蜱样本主要形态学特征 Table 1 Morphological characteristics of ticks in northwestern Yunnan
特征 微小扇头蜱
R. microplus		 卵形硬蜱
I. ovatus		 锐跗硬蜱
I. acutitarsus		 未知血蜱
Haemaphysalis sp.
雄 雌 雄 雌 雄 雌 雌
体形 椭圆形 椭圆形 卵圆形 卵圆形 卵圆形 卵圆形 逗点形
假头基 六角形 六角形 近五边形 近五边形 五边形 五边形 矩形，宽短
基突 短 很短 付缺 短小 付缺 付缺 很短
须肢 粗短 很粗短 长约宽的2倍 长约宽的3倍 较粗，长约宽的2倍 较窄长，长约宽的4倍 外侧突出, 呈角状
眼 小，扁平 小，卵圆形 无 无 无 无 无
盾板 较窄，两侧留下窄长的体缘 五边形，长大于宽 长卵圆形，侧缘弧度较小 亚圆形 卵圆形 心形 心形
缘垛 无 无 无 无 无 无 有
缘沟 无 无 明显，缘褶窄小 两侧明显 明显 深，缘褶肥大，后缘窄 不明显
气门板 长圆形，稍短 长圆形 卵圆形 近圆形 卵圆形 近圆形 近圆形
足 中等大小，按次序渐粗， 中等大小 中等大小 中等大小 稍长 稍长 中等大小
垫 短 短 与爪等长 长 短 短 未观察
肛沟 无 无 肛前沟 肛前沟 肛前沟 肛前沟 肛后沟
尾突 明显，呈三角形 无 无 无 无 无 无
表选项
图 1 云南省西北地区的2种蜱 Figure 1 Four species of ticks in northwestern Yunnan 注：微小扇头蜱(雌)：a1.背面，a2.腹面；卵形硬蜱(雌，肢体不完整)：b1.背面，b2.腹面；锐跗硬蜱(雄)：c1.背面，c2.腹面；未知血蜱(雌，肢体不完整)：d1.背面，d2.腹面
图选项
2.2 宿主动物的组成

寄生于耕牛体表的蜱种有微小扇头蜱(1 253只，占98.3%)、卵形硬蜱(7只，占0.6%)、锐跗硬蜱(4只，占0.3%)。寄生于家犬体表的蜱种有微小扇头蜱(10只，占0.8%)、未知血蜱(1只，占0.1%)，见表 2。

表 2 云南省西北地区蜱及其宿主动物的组成 Table 2 Ticks and hosts in northwestern Yunnan
宿主动物 微小扇头蜱
R. microplus		 卵形硬蜱
I. ovatus		 锐跗硬蜱
I. acutitarsus		 未知血蜱
Haemaphysalis sp.		 总计
只数 百分比(%) 只数 百分比(%) 只数 百分比(%) 只数 百分比(%) 只数 百分比(%)
耕牛 1 253 98.3 7 0.6 4 0.3 0 0.0 1 264 99.1
家犬 10 0.8 0 0.0 0 0.0 1 0.1 11 0.9
合计 1 263 99.1 7 0.6 4 0.3 1 0.1 1 275 100.0
表选项
2.3 蜱基因PCR检测及序列分析

对经形态学鉴定的微小扇头蜱(P6和P8)、卵形硬蜱(P2、P3、P5和P9)、锐跗硬蜱(P1和P7) 及未知血蜱(P4) 分别进行基因16S rDNA和ITS2片段扩增，结果样品P1~P9均检测出预期目的片段(见图 2)，检出率100.0%。

图 2 PCR检测蜱基因16S rDNA和ITS2片段结果 Figure 2 Results of PCR detection for tick 16S rDNA and ITS2 segments 注：P1、P7：I. acutitarsus；P2、P3、P5、P9：I. ovatus；P4：Haemaphysalis sp.；P6、P8：R. microplus；N：negative control；M：DL5000 DNA Marker
图选项
2.4 基因序列同源性分析

应用MegAlign软件将所获得的样本序列与GenBank中已知参考序列进行核苷酸相似性比较分析。16S rDNA序列分析显示：样品P6和P8的相似性100.0%，P6与印度微小扇头蜱(EU918188) 的相似性最高为99.8%，与中国云南省微小扇头蜱(JX051062) 的相似性99.4%；P2、P3、P5和P9的相似性100.0%，P2与美国卵形硬蜱(U95900) 的相似性最高为93.8%，与美国锐跗硬蜱(U95877) 的相似性为87.6%；P1和P7的相似性100.0%，P1与日本锐跗硬蜱(AB105167) 的相似性最高为95.9%，与美国锐跗硬蜱(U95877) 的相似性为94.2%，与P2的相似性为87.0%；P4与澳大利亚parva血蜱(JX573136) 的相似性为90.5%，与中国云南省长角血蜱(JX051064) 的相似性为88.7%；P1、P2、P4和P6之间的差异性为13.0%~27.1%。

ITS2序列分析显示：样品P6和P8的相似性100.0%，P6与来自老挝(KC503276)、柬埔寨(KC503272)、中国贵州省(JQ737125)、中国云南省(KC203364) 的微小扇头蜱的相似性均为99.9%；P2、P3、P5和P9的相似性100.0%，P2与日本卵形硬蜱(D88857) 的相似性最高为96.1%；P1与日本锐跗硬蜱(AB605168) 的相似性最高为95.3%，与P2的相似性为57.5%；P4与罗马尼亚Haemaphysalis parva血蜱(FN296282) 的相似性最高为91.0%；P1、P2、P4和P6之间的差异性在42.5%~62.2%。

2.5 系统进化树分析

根据蜱16S rDNA基因部分核苷酸序列进行系统进化树分析，结果显示P6与印度微小扇头蜱(EU918188) 在同一分支上，与中国云南省微小扇头蜱(JX051062) 不在同一分支上，表明P6与印度微小扇头蜱的亲缘关系较近，而与云南省微小扇头蜱的亲缘关系稍远；P2与美国卵形硬蜱(U95900) 在同一分支上，亲缘关系较近；P1与日本锐跗硬蜱(AB105167) 在同一分支上，亲缘关系较近；P4与澳大利亚parva血蜱(JX573136) 同属一支，亲缘关系较近，见图 3。

图 3 根据蜱16S rDNA基因部分序列构建系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of partial segments of tick 16S rDNA gene
图选项

据蜱ITS2基因部分核苷酸序列进行系统进化树分析，结果显示P6与来自柬埔寨(KC503272)、老挝(KC503276)、中国贵州省(JQ737125)、中国云南省(KC203364) 的微小扇头蜱在同一分支上，亲缘关系较近；P2与日本卵形硬蜱(U95900) 在同一分支上，亲缘关系较近；P1与日本锐跗硬蜱(AB605168) 在同一分支上，亲缘关系较近；P4与罗马尼亚parva血蜱在同一分支，亲缘关系较近，见图 4。

图 4 根据蜱ITS2基因部分序列构建系统进化树 Figure 4 Phylogenetic tree of partial segments of tick ITS 2 gene
图选项
3 讨论

蜱类的系统分类主要依靠传统的形态特征分类法，其优点是比较直观、操作简便、对环境条件要求低、鉴定成本低等，从而被长期广泛采用，但对鉴定人员的专业知识、工作经验等方面要求高。另外，形态学方法对一些外形相似蜱、肢体不完整蜱、亲缘种蜱等一些特殊蜱样较难以鉴定。随着分子生物学的发展，可通过检测蜱DNA分子对蜱类进行分子分类学研究[14-17]。目前主要采用检测线粒体16S rDNA、核糖体转录间隔ITS2等基因[18-21]，并将分子检测数据与形态学特征数据相结合，使蜱分类鉴定更加客观可靠。云南省蜱种类丰富，然而蜱类系统分类研究较少，系统发育学研究更滞后。

本次调查在云南省西北地区家养动物体表共捕获蜱1 275只，经形态学鉴定为1科3属4种：微小扇头蜱、卵形硬蜱、锐跗硬蜱和未知血蜱。蜱16S rDNA和ITS2基因核苷酸序列进化树分析显示，经形态学鉴定的微小扇头蜱、卵形硬蜱、锐跗硬蜱和未知血蜱分别与一些已知相对应的蜱种类聚，表明分子生物学鉴定与形态学结果完全一致。其中微小扇头蜱占99.1%，提示微小扇头蜱为该地区家畜体表蜱优势种群。寄生于耕牛体表的有微小扇头蜱、卵形硬蜱和锐跗硬蜱，家犬体表的有微小扇头蜱和未知血蜱，其中98.3%的微小扇头蜱采自耕牛体表。

基因16S rDNA进化速率较慢，结构保守，适合于研究属间、不同蜱种间的系统关系[15-16]。ITS2受外界环境的影响小，种内变异小，种间进化快、变异大，是种类鉴定和系统进化分析的重要标记[19-21]。本次通过对蜱基因16S rDNA和ITS2序列分析，结果显示两基因序列分析属间分类结果完全一致，而种内分析结果似乎存在一定分歧。目前蜱分类主要依靠形态学特征，分子检测工作较滞后，现有蜱种基因序列信息较少。本次序列分析时所选取的参照序列无法针对同一蜱的16S rDNA和ITS2序列同时获取进行分析，因此同一蜱的两基因序列种内分析结果似乎存在一些差异。检测到的4种蜱ITS2序列之间的差异性(42.5%~62.2%)明显大于16S rDNA序列(13.0%~27.1%)，表明ITS2种属间变异大于16S rDNA。本次检测的微小扇头蜱与来自印度、柬埔寨、老挝、中国贵州省、云南省的微小扇头蜱的亲缘关系较近，卵形硬蜱与来自日本、美国的卵形硬蜱的亲缘关系较近，锐跗硬蜱与来自日本的锐跗硬蜱的亲缘关系较近。未知血蜱与罗马尼亚和澳大利亚parva血蜱的亲缘关系相对较近，序列相似性在91.0%~90.5%，而与中国云南省长角血蜱(JX051064) 的相似性仅88.7%，结合形态学鉴定结果，提示本次检测到的未知血蜱为一血蜱新种。

作者贡献:

亚红祥  ORCID：0000-0002-9917-9420

亚红祥：形态学分类、实验室检测、结果分析、论文撰写

沈姝：参与形态学分类、分子鉴定指导

苏正元：参与形态学分类和实验室检测

邓菲：指导

张云智：样品的收集和指导

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