疾病监测  2017, Vol. 32 Issue (8): 683-686

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刘笑舒, 廖凤, 于栓宝, 李文革, 陈小萍, 吴媛, 卢金星
LIU Xiao-shu, LIAO Feng, YU Shuan-bao, LI Wen-ge, CHEN Xiao-ping, WU Yuan, LU Jin-xing
咔哒唑胺与利奈唑胺对艰难梭菌的敏感性实验
Sensitivity test of Clostridium difficile to cadazolid and linezolid
疾病监测, 2017, 32(8): 683-686
Disease Surveillance, 2017, 32(8): 683-686
10.3784/j.issn.1003-9961.2017.08.017

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收稿日期：2017-01-16
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刘笑舒, 廖凤, 于栓宝, 李文革, 陈小萍, 吴媛, 卢金星. 咔哒唑胺与利奈唑胺对艰难梭菌的敏感性实验[J]. 疾病监测, 2017, 32(8): 683-686.
LIU Xiao-shu, LIAO Feng, YU Shuan-bao, LI Wen-ge, CHEN Xiao-ping, WU Yuan, LU Jin-xing. Sensitivity test of Clostridium difficile to cadazolid and linezolid[J]. Disease Surveillance, 2017, 32(8): 683-686.
咔哒唑胺与利奈唑胺对艰难梭菌的敏感性实验
刘笑舒1, 廖凤2, 于栓宝1, 李文革1, 陈小萍1, 吴媛1, 卢金星1     
1. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所医院感染室传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
2. 云南省第一人民医院, 云南 昆明 650034
收稿日期：2017-01-16
基金项目：中英合作项目（No.70029）
作者简介：刘笑舒, 女, 黑龙江省巴彦县人, 研究生在读, 主要从事艰难梭菌分子流行病学研究; 廖凤, 女, 云南省昭通市大关县人, 主治医师, 主要从事呼吸系统疾病治疗, 呼吸道和肠道病原体研究等工作.
通信作者：吴媛, Tel:010-58900763, Email:wuyuan@icdc.cn; 卢金星, Tel:010-58900705, Email:lujinxing@icdc.cn.
刘笑舒和廖凤同为第一作者
摘要：目的 比较咔哒唑胺与利奈唑胺对不同基因和毒素型别的艰难梭菌的抑菌效果，以及咔哒唑胺对艰难梭菌芽孢形成的影响。方法 采用咔哒唑胺与利奈唑胺对10株不同基因型别的艰难梭菌、1株产气荚膜梭菌和1株脆弱拟杆菌进行药物敏感性实验，获得各菌株测试药物对应的最低抑菌浓度（MIC）值。选取其中1株艰难梭菌ATCC BAA-1803，核糖体027型高毒株，试验咔哒唑胺对菌株芽孢形成的影响，从而对药物进行评价。结果 艰难梭菌咔哒唑胺MIC为0.25 μg/ml（0.03~0.25 μg/ml），利奈唑胺MIC为4.0 μg/ml（0.5~16.0 μg/ml），艰难梭菌咔哒唑胺MIC值低于利奈唑胺16倍。2种抗生素对不同基因型别与毒素型别的艰难梭菌均具有良好抑菌效果，同时对产气荚膜梭菌也具有抑菌效果。咔哒唑胺对脆弱拟杆菌不产生抑菌效果，利奈唑胺对其有抑菌效果。咔哒唑胺能抑制艰难梭菌芽孢形成。结论 临床常见的不同基因型和毒素型别的艰难梭菌对咔哒唑胺敏感，咔哒唑胺可用于治疗艰难梭菌感染。
关键词：艰难梭菌    咔哒唑胺    利奈唑胺    药敏    芽孢    
Sensitivity test of Clostridium difficile to cadazolid and linezolid
LIU Xiao-shu1, LIAO Feng2, YU Shuan-bao1, LI Wen-ge1, CHEN Xiao-ping1, WU Yuan1, LU Jin-xing1     
1. State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
2. The First People's Hospital of Yunnan Province, Kunming 650034, Yunnan, China Corresponding authors:WU Yuan, Email:wuyuan@icdc. cn; LU Jin-xing, Email:lujinxing@icdc. cn
This study was supported by the fund for Chinese-British Cooperation Projects(No.70029)
Corresponding author: WU Yuan, E-mail:wuyuan@icdc.cn; LU Jin-xing, E-mail:lujinxing@icdc.cn.
Abstract: Objective To compare the antibacterial effect of cadazolid and linezolid to Clostridium difficile with different genotype and toxin type, and the effect of cadazolid on the formation of C. difficile spores. Methods The sensitivity of 10 strains of C. difficile, 1 strain of C. lostridium perfringens and 1 strain of Bacteroides fragilis to cadazolid and linezolid were tested. The MICs of cadazolid and linezolid to the tested strains were obtained. One strain of C. difficile(ATCC BAA-1803, RT027) was selected to evaluate the effect of cadazolid on the spore formation of the strain. Results The MIC of cadazolid to C. difficile was 0.25 μg/ml (0.03-0.25 μg/ml), the MIC of linezolid to C. difficile was 4.0 μg/ml (0.5-16.0 μg/ml), the MIC of cadazolid was 16 times lower than that of linezolid. The two antibiotics had good antibacterial effect to C. difficile with different genotype and toxin type, and also had antibacterial effect on C. perfringens. Cadazolid had no inhibitory effect on B. fragilis, while linezolid had such effect. Cadazolid could inhibit the formation of C. difficile spores. Conclusion C. difficile is sensitive to cadazolid, indicating thatcadazolid is effective in the clinical treatment of C. difficile infection.
Key words: Clostridium difficile     Cadazolid     Linezolid     Sensitivity     Spore    

艰难梭菌(Clostridium difficile)是一种严格厌氧的革兰阳性芽孢杆菌，以产A/B毒素以及少量菌株产二元毒素致病。15%~20%的抗生素药物治疗后产生的腹泻由艰难梭菌导致，它也是成年人医院感染性腹泻的主要病因。艰难梭菌感染(CDI)临床表现变化大，可从无症状至温和的自限性腹泻，再导致比较严重的伪膜性肠炎、结肠炎症和组织损伤，甚至巨结肠症、肠穿孔、败血症以及中毒性休克等[1-2]。CDI的患病率和病死率居高不下，是导致老年住院患者发病以及死亡的主要原因。美国、加拿大以及欧洲的多项调查研究表明，随着强毒株核糖体027型以及核糖体078型的出现，CDI呈上升趋势，已经成为全球公共卫生的新挑战[1-9]。如何高效及时地防控艰难梭菌感染成为难题。治疗CDI的主要抗菌药物有万古霉素与甲硝唑，但治疗效果不佳，复发率高，菌株的耐药形式也越发严峻[10-12]。同时，CDI的治疗也导致肠道菌群对万古霉素产生耐药性[13]。咔哒唑胺是一种新型噁唑烷酮类药物，目前已用于CDI性腹泻的治疗[14]。本实验采用咔哒唑胺与利奈唑胺，对10株不同基因型别的艰难梭菌、1株产气荚膜梭菌和1株脆弱拟杆菌进行药物敏感性实验，获得各菌株测试药物对应的最低抑菌浓度(minimun inhibitory concentration，MIC)值。选取其中1株艰难梭菌，试验咔哒唑胺对菌株芽孢形成的影响，从而对药物进行评价。

1 材料与方法 1.1 实验菌株

选择10株艰难梭菌，其中4株ATCC菌株具有代表性的毒素特征和基因型，包括具有高致病性的艰难梭菌的高毒株核糖体027型ATCC BAA-1803；其余6株为临床分离样本；不同基因型别的艰难梭菌，拟用以对比不同基因型别菌株对药物敏感度的差异；另外，1株产气荚膜梭菌和1株脆弱拟杆菌作为对照，对2种药物咔哒唑咹与利奈唑胺进行敏感性测试。选择艰难梭菌高产毒株ATCC BAA-1803对药物咔哒唑咹进行芽孢形成影响的实验，见表 1。

表 1 菌株信息 Table 1 Information of strains used in study
菌株名称编号核糖体/
ST型别		毒素型别
艰难梭菌ATCC BAA-1803027A+B+, cdtB+
艰难梭菌ATCC 9689001A+B+, cdtB-
艰难梭菌ATCC 700057038A-B-, cdtB-
艰难梭菌ATCC 43598017A-B+, cdtB-
艰难梭菌SH 0201-018017A-B+, cdtB-
艰难梭菌XA 0204-005ST54A+B+, cdtB-
艰难梭菌HZ 0206-001ST1A+B+, cdtB+
艰难梭菌TAFY 36ST3A+B+, cdtB-
艰难梭菌ZR22ST35A+B+, cdtB-
艰难梭菌GZ15ST119A-B-, cdtB-
产气荚膜梭菌ATCC 13124
脆弱拟杆菌ATCC 25285
表选项
1.2 主要仪器及试剂

恒温厌氧培养箱(德国Memmert)，温控高速离心机(德国Eppendorf)，布氏培养基(美国BD)，琼脂粉(美国BD)，ddH2O (美国Gibco)，DMSO(日本Sigma)，脱纤维羊血(北京宝特)，氯化血红素和维生素K(北京陆桥)。

1.3 方法 1.3.1 贮存浓度药物制备

将试验药物使用相应溶剂分别配制成浓度3 840 μg/ml的储存液，置-70 ℃冰箱中备用；使用DMSO溶解咔哒唑胺，使用ddH2O溶解利奈唑胺。本实验标准使用clinical and laboratory standards institute (CLSIM) M11-A7关于确定厌氧菌MICs的指导文件。

1.3.2 含抗生素平板制备

布氏琼脂培养基高压灭菌(121 ℃，20 min)后待其温度降到50 ℃，加入羊血、氯化血红素和维生素K，其终浓度分别为5%、1‰和1‰；加入试验抗生素，制备浓度范围0.5~16.0 μg/ml的平板(梯度浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/ml)；若无菌株生长，未得出MIC值，则制备浓度范围0.03~0.25 μg/ml的平板(梯度浓度分别为0.031、0.063、0.125、0.25 μg/ml)再次实验。

1.3.3 菌悬液制备及药敏实验

将冻存菌株接种在布氏琼脂血平板上培养，挑取单菌落第2次接种培养(艰难梭菌48 h；产气荚膜梭菌和脆弱拟杆菌24 h)；用布氏培养液制备菌悬液(0.5 McF麦氏浊度)。吸取制备好的菌悬液2 μl，点接种到相应浓度的抗生素平板及对照平板上，每个平板接种9个点。每个菌株的每一种药物平板按照试验前有氧、厌氧，浓度由低到高，试验后厌氧、有氧的顺序依次接种。37 ℃，厌氧培养48 h，需氧对照平板在有氧环境中培养48 h。

1.3.4 咔哒唑胺对艰难梭菌芽孢形成影响实验

艰难梭菌(ATCC BAA-1803) 在布氏培养液(1‰氯化血红素和1‰维生素K)中37 ℃厌氧培养6~7 h至对数生长期(约0.5 McF麦氏浊度)；将20 μl菌悬液加入到含有1 ml布氏培养液(含浓度0.03~0.25 μg/ml的抗生素)中，37 ℃厌氧培养4 d。将MIC定义为完全抑制可见生长(浊度)的浓度，0.5×MIC是容许可见生长药物的最高浓度。

吸取40 μl菌悬液加入到2 ml布氏培养液(含0.5×MIC浓度的抗生素)中，37 ℃厌氧培养48 h和96 h。全部细胞菌落形成单位(CFU)评价：培养物100 μl的10倍稀释液涂布于布氏琼脂血平板上，37 ℃厌氧培养48 h，对菌落计数(N1)。在室温下，向菌液添加1倍体积无水乙醇处理1 h，选择性杀死营养细胞，随后涂布于布氏琼脂血平板上，37 ℃厌氧培养48 h，对芽孢计数(N2)。参考文件CN102014903A专利说明书-20-27部分。平行设置空白对照。

1.4 数据分析

药敏实验中得到不同基因型别艰难梭菌的MIC值。芽孢形成实验中得到MIC值与芽孢形成率(N2/N1)。

2 结果

实验得到各菌株对2种药物的MIC值，见表 2。艰难梭菌咔哒唑胺MIC为0.25(0.03~0.25)μg/ml，利奈唑胺MIC为4.0(0.5~16.0)μg/ml，咔哒唑胺MIC值低于利奈唑胺16倍。2种抗生素对不同基因型别、毒素型别的艰难梭菌均有抑菌作用，其中艰难梭菌的高毒株核糖体027型菌株(ATCC BAA-1803) 咔哒唑胺MIC为0.25 μg/ml，利奈唑胺MIC为4.0 μg/ml，2种抗生素对高毒致病株有有效的抑菌效果。具有相同基因型的菌株，对药物的耐药能力不同。具有相同毒素类型的菌株，对药物的耐药能力并不相同。2种药物对不同毒素基因类型菌株MIC值比较见图 1。2种药物同时对产气荚膜梭菌有良好抑菌效果：咔哒唑胺MIC为0.125(0.03~0.25)μg/ml，菌株利奈唑胺MIC为4.0(0.5~16.0)μg/ml。同时，咔哒唑胺对脆弱拟杆菌无抑菌效果，而利奈唑胺对其有抑菌效果，MIC值为8.0(0.5~16.0)μg/ml。2种药物的抑菌效果见表 3、4。

表 2 各菌株测试药物对应最低抑菌浓度值 Table 2 MICs of two antibiotics to strains
菌株名称最低抑菌浓度(μg/ml)
咔哒唑胺利奈唑胺
艰难梭菌SH 0201-0180.2504.0
艰难梭菌TAFY 360.1252.0
艰难梭菌ZR220.2502.0
艰难梭菌ATCC 7000570.2504.0
艰难梭菌XA 0204-0050.1252.0
艰难梭菌GZ150.1252.0
艰难梭菌HZ 0206-0010.2504.0
艰难梭菌ATCC96890.2502.0
艰难梭菌ATCC BAA-18030.2504.0
艰难梭菌ATCC 435980.2502.0
产气荚膜梭菌ATCC 131240.1254.0
脆弱拟杆菌ATCC 25285NA8.0
注：NA为咔哒唑胺对脆弱拟杆菌无杀菌作用
表选项
图 1 2种药物对不同毒素基因型菌株的最低抑菌浓度 Figure 1 MICs of two antibiotics to strains with different toxin type
图选项
表 3 咔哒唑胺不同浓度抑菌效果(0.03~0.25 μg/ml) Table 3 Inhibitory effect of cadazolid at concentration of 0.03－0.25 μg/ml
菌株对照
需氧		对照
厌氧		药物浓度(μg/ml)对照
厌氧		对照
需氧
0.0310.0630.1250.250
ATCC BAA-1803-++++-+-
ATCC 9689-++++-+-
ATCC 700057-++++-+-
ATCC 43598-++++-+-
SH 0201-018-++++-+-
XA 0204-005-+++--+-
HZ 0206-001-++++-+-
TAFY 36-+++--+-
ZR22-++++-+-
GZ15-+++--+-
ATCC 13124-+++--+-
ATCC 25285-++++++-
表选项
表 4 利奈唑胺不同浓度抑菌效果(0.5~16.0 μg/ml) Table 4 Inhibitory effect of linezolid at concentration of 0.5－16.0 μg/ml
菌株对照
需氧		对照
厌氧		药物浓度(μg/ml)对照
厌氧		对照
需氧
0.51.02.04.08.016.0
ATCC BAA-1803-++++---+-
ATCC 9689-+++----+-
ATCC 700057-++++---+-
ATCC 43598-+++----+-
SH 0201-018-++++---+-
XA 0204-005-+++----+-
HZ 0206-001-++++---+-
TAFY 36-+++----+-
ZR22-+++----+-
GZ15-+++----+-
ATCC 13124-++++---+-
ATCC 25285-+++++--+-
表选项

芽孢形成影响实验发现艰难梭菌(ATCC BAA-1803) 咔哒唑胺的MIC为0.25 μg/ml。在含0.125 μg/ml咔哒唑胺的布氏培养液(96 h)中无芽孢形成；在布氏培养液(不含抗生素)中的芽孢形成率为2.610×10-4。

3 讨论

咔哒唑胺是新型的噁唑烷酮类抗菌药物，是一种嵌合药物，将2种具有不同作用机制的药物相结合，在噁唑烷酮结构的基础上增加了一个氟喹诺酮的侧链，使药物活性更强、降低耐药率[14]。咔哒唑胺的主要作用方式为抑制细菌蛋白的合成，可干扰细菌蛋白的翻译，能够抑制艰难梭菌A、B毒素的形成[15]。同时具有抑制芽孢形成的作用。

本研究发现艰难梭菌咔哒唑胺的MIC为0.25 μg/ml，利奈唑胺的MIC为4.0 μg/ml，艰难梭菌对咔哒唑胺的MIC值低于利奈唑胺16倍，咔哒唑胺对艰难梭菌有更高效的杀菌作用。艰难梭菌的高毒株(核糖体027型菌株ATCC BAA-1803) 咔哒唑胺的MIC为0.25 μg/ml。具有相同基因型的菌株，对药物的耐药能力不同。具有相同毒素类型的菌株，对药物的耐药能力并不相同。菌株的产毒增加与其对药物的耐受性不成正比。2种药物同时对产气荚膜梭菌有良好抑菌效果：产气荚膜梭菌咔哒唑胺的MIC为0.125 μg/ml，利奈唑胺的MIC为4.0 μg/ml。咔哒唑胺对脆弱拟杆菌不产生效果，说明其并不对此类肠道正常菌群产生抑菌作用，而利奈唑胺对其有抑菌效果，MIC为8.0 μg/ml。

研究发现艰难梭菌(ATCC BAA-1803) 在布氏培养液中咔哒唑胺的MIC值为0.25 μg/ml，在含0.5×MIC浓度(0.125 μg/ml)咔哒唑胺的布氏培养液中无芽孢形成，而对照组的芽孢形成率为2.610×10-4。咔哒唑胺有明显的抑制芽孢形成的作用。芽孢抵抗理化作用的能力强，产芽孢细菌的芽孢是其重要的致病作用因子，咔哒唑胺能有效杀灭芽孢，是治疗艰难梭菌感染的高效药物。咔哒唑胺对脆弱拟杆菌并不产生抑菌效果，表明对其他种肠道菌群的影响相对低于利奈唑胺，能够更适用于多种微生物共存的肠道环境的治疗，该药物可针对特殊致病菌，并不过分影响肠道正常微生态环境，能减少抗生素治疗过程中产生的再次感染。

综合考虑抑菌效果、抑制芽孢生长的作用以及对其他种肠道细菌的影响，目前使用咔哒唑胺治疗艰难梭菌感染是相对有效的方法。

作者贡献:

刘笑舒  ORCID：0000-0001-9233-1576

廖凤  ORCID：0000-0001-7528-9513

刘笑舒：实验操作，论文撰写

廖凤：标本收集、筛选，实验操作

于栓宝：实验操作

李文革：实验操作

陈小萍：实验操作

吴媛：论文修改

卢金星：项目指导，论文修改

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