2018, Vol. 33扩展功能
文章信息
- 张婧, 李加全, 冯云, 韩茜, 潘虹, 杨和仙, 张海林, 宋志忠
- Zhang Jing, Li Jiaquan, Feng Yun, Han Xi, Pan Hong, Yang Hexian, Zhang Hailin, Song Zhizhong
- 云南省保山市蚊虫中检测到基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒
- Identification of Japanese encephalitis virus genotype Ⅰ from mosquitoes in Baoshan, Yunnan
- 疾病监测, 2018, 33(2): 150-154
- Disease Surveillance, 2018, 33(2): 150-154
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.02.009
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文章历史
- 收稿日期：2017-11-17
2. 大理大学公共卫生学院, 云南 大理 671000;
3. 保山市疾病预防控制中心, 云南 保山 678000;
4. 云南省疾病预防控制中心, 云南 昆明 650022
2. Public Health College, Dali University, Dali 671000, Yunnan, China;
3. Baoshan Prefecture Center for Disease Control and Prevention, Baoshan 678000, Yunnan, China;
4. Yunnan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Kunming 650022, Yunnan, China
保山市位于云南省西部，属南亚热带气候，适于蚊虫孳生繁殖和虫媒病毒的传播，并广泛存在流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，乙脑)等多种蚊媒传染病的流行[1-4]。该市辖隆阳区、腾冲市、施甸县、昌宁县和龙陵县，与缅甸接壤并设有国家级边境口岸，境内外人员和物质交流频繁。20世纪80年代曾从保山市隆阳区三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)中分离到乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)。2007年和2010年相继从腾冲市三带喙库蚊以及相邻德宏傣族景颇族自治州(德宏州)三带喙库蚊等多种蚊虫中分离到JEV、盖塔病毒(Getah virus，GETV)、阿卡斑病毒(Akabane virus，AKV)和曼扎尼拉病毒(Manzanilla virus，MANV)等[5-11]。为了解近期保山市蚊虫自然感染虫媒病毒状况，本研究采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription -polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，对2015年在保山市隆阳区采集的蚊虫标本进行JEV等虫媒病毒核酸检测及序列测定和分析，为相关蚊媒病毒病防治提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 标本采集2015年9月在保山市隆阳区人房和畜圈(猪圈和牛圈)用诱蚊灯采集蚊虫标本，每个采集点各采集2 d，黄昏前安放诱蚊灯，次日晨取回诱蚊纱笼。捕获蚊虫置-20 ℃冷冻30 min致死，蚊虫经分类鉴定，计数分装后，放入2 ml冻存管，液氮运送到云南省地方病防治所病毒实验室检测。
1.2 蚊虫研磨处理从液氮罐中取出蚊虫冻存管，在P2实验室的生物安全柜内将蚊虫标本倒入预冷的无菌乳钵中，加入无血清MEM液(含10%双抗和1%谷氨酰胺)，蚊虫研磨后移入1.5 ml离心管中，在4 ℃，12 000 r/min离心(半径8.27 cm)30 min，研磨上清液用于RT-PCR。
1.3 RT-PCR采用RT-PCR检测多种虫媒病毒核酸。用QIAamp Viral RNA Mini Kit(美国QIAGEN公司)试剂盒提取蚊虫研磨上清液中的病毒RNA，使用随机引物pdN6和Ready -to -GoTM You First -Strand Beads(美国GE Healthcare公司)制备cDNA。用Thermo公司的DreamTaq PCR Master Mix(2×)并使用黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)[12]、披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)[13]和布尼亚病毒科(Bunyaviridae)布尼亚病毒属(Bunyavirus)[14]以及JEV引物[15]进行PCR扩增，反应体系25 μl，Green Master Mix 12.5 μl、Nuclease-Free water 9.5 μl、正、反向引物各0.5 μl、cDNA 2 μl，充分混匀，再根据反应条件进行扩增，虫媒病毒引物信息见表 1。反应结束后，取2 μl产物进行1%琼脂糖凝胶电泳；检测扩增效果。
| 病毒名称 | 引物名称 | 扩增片段 | 序列(5’~3’) | 扩增长度(bp) |
| 黄病毒属 | FU1 | NS5 | TACC ACA TGA TGG GAA AGA GAG AGA A | |
| CFD2 | NS5 | GTG TCC CAG CCG GCG GTG TCA TCA GC | 310 | |
| 流行性乙型脑炎病毒 | JEV-251F | C/PrM | CGT TCT TCA AGT TTA CAG CAT TAG C | |
| JEV-925R | C/PrM | CCY RTG TTY CTG CCA AGC ATC CAM CC | 674 | |
| JEV-743R | C/PrM | CCY RTG TTY CTG CCA AGC ATC CAM CC | 492 | |
| 布尼亚病毒属 | BDW | S segment | ATG ACT GAG TTG GAG TTT GAT GTC GC | |
| BUP | S segment | TGT TCC TGT TGC CAG GAA AAT | 251 | |
| 甲病毒属 | M2W | Alphavirus | YAG AGC DTT TTC GCA YST RGC HW | 434 |
| M2W2 | Alphavirus | TGY CCN VTG MDN WSY VCN GAR GAY CC | 310 | |
| CM3W | Alphavirus | ACA TRA ANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||
| 注：F为正向引物；R为反向引物。M:C/A；W:A/Y；Y:C/T；K:G/T；R:G/A；V:G/A/C；D:T/A/G | ||||
对PCR扩增阳性的产物进行序列测定，所有测序在生工生物工程(上海)股份有限公司昆明办事处完成。使用DNAstar软件包中的SeqMan对序列片段进行拼接、编辑、校正；用Clustal X(1.83)软件进行碱基配对以及核苷酸和推导氨基酸序列同源性分析；应用MEGA 5.0软件邻接法(neighbor-joining)构建系统进化树。本研究引用来自GenBank中21株JEV C/PrM基因序列，其中16株为基因Ⅰ型(Genotype-Ⅰ，G-Ⅰ)、1株基因Ⅱ型(G-Ⅱ)、2株基因Ⅲ型(G-Ⅲ)、1株基因Ⅳ型(G-Ⅳ)和1株基因Ⅴ型(G-Ⅴ)，外群为黄热病毒(Yellow fever virus)美洲株(79A，AF094612)。
2 结果 2.1 蚊虫分布在保山市芒宽乡(顶敢村)、辛街乡、汉庄镇(蒿子村)、瓦窑镇(老营村)、板桥镇(北汉庄村和乌龙村)共捕获蚊虫3属(库蚊、按蚊和阿蚊)3种8 202只，其中三带喙库蚊7 259只，构成比为88.50%；中华按蚊(Anopheles sinensis)937只，构成比为11.43%；骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)6只，构成比0.07%。在人房、猪圈和牛圈分别捕获429只(三带喙库蚊315只、中华按蚊114只)、782只(三带喙库蚊636只、中华按蚊140只和骚扰阿蚊6只)和6 991只(三带喙库蚊6 308只，中华按蚊683只)。
2.2 虫媒病毒核酸检测按蚊虫种类及采集地点和生境将所有捕获蚊虫分为30批进行研磨，每批约300只蚊虫，从研磨上清液中提取病毒核酸并制备cDNA，经PCR扩增，仅在JEV引物扩增组中从14批三带喙库蚊中检测到相应的明亮条带。黄病毒属引物未检测到明显条带，甲病毒属和布尼亚病毒属引物的检测均为阴性。
2.3 JEV序列测定将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司昆明办事处进行序列测定，从上述17批PCR阳性扩增产物中获得14株JEV的C/PrM基因核苷酸序列(492 bp)，其中来自芒宽乡敢顶村2株(BSM1502和BSM1503)，板桥镇北汉庄村7株(BSM1510、BSM1516、BSM1517、BSM1519、BSM1520、BSM1521和BSM1522)，板桥镇乌龙村5株(BSM1513、BSM1525、BSM1527、BSM1528和BSM1529)。除BSM1510株来自板桥镇北汉庄村猪圈捕获的三带喙库蚊外，其余13株均来自牛圈捕获的三带喙库蚊(图 1)。
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| 图 1 2015年云南省保山市14株流行性乙型脑炎病毒PrM基因核苷酸序列系统进化分析 Figure 1 Phylogenetic analysis based on PrM gene sequence of 14 JEV strains from Baoshan, 2015 注：▲为本次保山市流行性乙型脑炎病毒株 |
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本次保山市14株JEV C/PrM基因核苷酸序列与来自GenBank的22株JEV国内外参考株C/PrM基因核苷酸序列构建系统进化树。所有保山株高度聚集在同一进化支，并与JEV G-Ⅰ参考株处于同一进化支，基因型同属G-Ⅰ，它们与JEV的G-Ⅱ、G-Ⅲ、G-Ⅳ和G-Ⅴ病毒株进化关系较远。保山市14株均与2010年德宏州芒市(DH10M865)、瑞丽市(DH10M978)及2007年保山腾冲市(YNTC07172)流行株同处一个进化分支，亲缘关系最近，并与四川(SC0415)和广西(GX0519)流行株具有较近的亲缘关系，见图 1。
2.5 同源性分析对保山市14株JEV与6株JEV各基因型参考株进行PrM基因(240 bp)核苷酸和氨基酸同源性分析。保山市14株JEV间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.2%~100%和98.8%~100%。与2007年腾冲市G-Ⅰ分离株(YNTC07172)的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.2%~99.6%和98.8%~ 100%，与2010年瑞丽市G-sⅠ株(DH10M978)的核苷酸和氨基酸同源性为98.3%~98.8%和97.5%~ 98.8%，与G-Ⅱ、G-Ⅲ、G-Ⅳ和G-Ⅴ参考株的核苷酸(氨基酸)同源性依次为85.4%~85.8%(93.8%~ 95.0%)、83.8%~84.2%(95.0%~96.2%)、76.7%~ 77.5%(86.2%)和71.7%~72.1%(81.2%~82.5%)。
3 讨论蚊虫是虫媒病毒的重要传播媒介，但不同种类虫媒病毒的媒介蚊种不同，因此，掌握各地蚊虫分布及其自然感染虫媒病毒状况，对蚊媒传染病防控有重要意义。云南省位于我国西南边陲，属南亚热带气候，具有众多生物群落和虫媒传染病复杂的特点。从不同蚊虫种类中分离到黄病毒属JEV和登革热病毒(Dengue virus)、甲病毒属GETV和辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、布尼亚病毒属巴泰病毒(Batai virus)及AKV和MANV以及环状病毒属(Orbivirus)等10多种虫媒病毒[5-11, 16-17]。
本次调查表明，三带喙库蚊为保山市居民区人房和畜圈的优势蚊种，中华按蚊亦属当地常见蚊种，与以往调查结果相似[3, 5]。鉴于黄病毒属、甲病毒属和布尼亚病毒属中包含较多种类的蚊传虫媒病毒，本次同时使用这3个属特异性引物和JEV引物对所有蚊虫标本进行RT-PCR法检测，结果从三带喙库蚊中扩增到14株JEV的C/prM基因序列，其他病毒的检测均为阴性。由此认为，JEV在当地蚊虫中广泛分布，三带喙库蚊是JEV主要传播媒介。本次牛圈、猪圈和人房捕获的三带喙库蚊分别占该蚊总数的86.90%(6 308/7 259)、8.76%(636/7 259)和4.34%(315/7 259)，且检测到的14株JEV中，13株来自牛圈的三带喙库蚊，1株来自猪圈的三带喙库蚊，与不同生境捕获该蚊数量有关。猪被认为是JEV的主要扩散宿主[18]，但本研究还表明牛不仅是当地该蚊的重要吸血宿主动物，亦在JEV扩散中具有重要作用。本次采蚊点的猪圈和牛圈均与人房相连，特殊的居住环境容易导致JEV在不同宿主间的相互传播及人类的感染和发病。
JEV属于黄病毒属成员，本次JEV引物扩增阳性的14份标本同时用黄病毒属引物扩增，仅从JEV引物扩增阳性的部分蚊悬液样本中检测到不明显的黄病毒属扩增条带，提示该黄病毒属引物可能难以有效扩增到蚊虫标本中的JEV核酸，对该引物的属特异性尚需进一步验证。
目前，JEV可分为5种基因型(G-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)[18-20]，我国有3种基因型(G-Ⅰ、G-Ⅲ和G-Ⅴ)流行[18]，其中G-Ⅰ和G-Ⅲ分布广泛，G-Ⅴ仅从西藏自治区林芝地区墨脱县三带喙库蚊中分离到[21]。云南省为我国乙脑主要流行区，JEV基因型主要为G-Ⅰ和G-Ⅲ，2005年以前主要流行G-Ⅲ，而2005－ 2010年流行株则以G-Ⅰ为主[22-23]。20世纪80年代曾从保山市隆阳区三带喙库蚊中分离到基因Ⅲ型JEV[5, 22-23]，2007年腾冲县三带喙库蚊等蚊虫中分离到的JEV均为基因Ⅰ型[6]，本次检测到G-Ⅰ病毒为隆阳区首次报道，亦为近10年保山市首次检测到该基因型病毒，提示G-Ⅰ已成为该市JEV的主要基因型。本次JEV C/prM基因序列分析表明，保山市2015年流行株与2007年腾冲市及2010年德宏州芒市和瑞丽市流行株高度同源，表明隆阳区JEV流行株具有滇西地区JEV流行株的地域特征。鉴于2010年以后云南省未见有关JEV基因分型的报道，因此，本次检测到JEV G-Ⅰ病毒株亦为近几年云南省首次，此结果对了解云南省JEV基因型的地区和时间分布具有重要流行病学意义。
乙脑在云南省广泛分布，保山市为云南省乙脑主要流行区，虽然近几年该市乙脑发病有下降趋势[1-2]，但本次调查发现，保山市乙脑主要传播媒介三带喙库蚊分布广、密度高并具有较高的JEV自然感染率，仍需进一步加强该地区乙脑病例及其媒介蚊虫的监测和防控，以减少该病对人群健康和生命安全的危害。
志谢: 保山市隆阳区疾病预防控制中心以及芒宽乡、汉庄镇、瓦窑镇和板桥镇卫生院在蚊虫标本采集中给予了大力支持，特此感谢作者贡献:
张婧 ORCID：0000-0002-3483-5239
张婧：病毒检测及撰写论文
李加全、杨和仙：参与标本采集
冯云：指导实验和序列分析
韩茜、潘虹：参与病毒检测
张海林：指导和数据分析及论文修改
宋志忠：论文指导
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