副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种嗜盐革兰阴性杆菌，广泛存在于贝类、鱼、虾等海产品中，因交叉污染等在淡水产品中也大量检出^[1]。经食源性感染VP后，可引起腹泻、发热、血便等急性肠胃炎症状^[2]。目前，VP根据血清学分型包括13种O和74种K血清的不同组合^[3]。在流行病调查时，VP血清型并不能完全解释事件的相关性，通常还需辅以脉冲场凝胶电泳（Pulsed - field gel electrophoresis，PFGE）等分子分型手段，以更清晰地明确菌株相关性以及污染溯源^[4]。目前，国家致病菌识别网和PulseNet China以PFGE图谱构建了VP指纹图谱数据库，用于VP流行和暴发调查，并取得成果^[5]。大量调查发现，分离自腹泻患者的大多数VP携带耐热直接溶血素基因（tdh）或相关溶血素基因（trh），而来源于食品或环境样品的菌株极少数检测这2个基因^[2]。因此，常以是否携带这2个基因判断菌株的致病性，携带其一或同时携带2个基因菌株才被认为是致病VP。但也有不携带该2个基因的菌株感染引起腹泻的相关报道^[6]。1996年后有一大克隆群的VP在全球各地引起感染率急剧上升，被称为“大流行株”，经调查发现，该群菌均携带有噬菌体f237独特的开放阅读框ORF8基因片段。因此，ORF8常被检测以判断该菌的流行强度和作为“大流行株”的判断依据^[7]。这些相关毒力基因在流行调查时均不能忽视。

2017年9月广西壮族自治区某乡村举办丧宴，多名用餐人员出现呕吐、腹泻等急性肠胃炎症状，从入院腹泻患者13份肛拭标本中分离出10株VP。高度怀疑食物—对虾未留样，无法开展相关检测；其他食品、环境和生活饮用水等样品均未检出VP。为进一步调查该起事件性质，我们对这些分离株的血清型、毒力基因、PFGE分子分型等进行研究，并利用Bionumerics 6.6软件进行聚类分析，调查该起事件的特性，现将结果报告如下。

从10名参加丧宴后出现呕吐或腹泻的急性肠胃炎患者肛拭子分离10株VP，编号为VP500~VP509。

所有可疑菌株经分离纯化后，利用VITEK 2 compact生化鉴定仪（生物梅里埃，法国）按照仪器操作规程进行生化鉴定。挑取斜面纯培养物用诊断血清（生研株式会社，日本）按产品说明书进行O抗原和K抗原玻片凝集实验。

选择4个（tlh、tdh、trh和ORF8）与VP致病性相关的基因，采用CFX96荧光定量PCR仪（BIO-RAD，美国）通过TaqMan水解探针的多重荧光PCR方法进行检测。探针和引物参照文献[8]由Invitrogen生物技术有限公司（上海）合成。模板DNA用热裂解法提取，结果根据循环阈值（Ct）判定，Ct＜34为阳性；Ct≥34为阴性。

参照国家致病菌识别网PFGE技术规范-VP脉冲场凝胶电泳标准操作方案进行，主要步骤：将培养16~18 h的新鲜菌落制备菌悬液，取等体积菌悬液与融化的1% SeaKem Gold琼脂糖（美国CAMBREX BIOSCIENCE ROCKLAND）混匀，制备Plug。经原位裂解后，用超纯水和TE（美国Invitrogen）溶液清洗。用限制性内切酶Sfi Ⅰ和Not Ⅰ[宝生物工程（大连）有限公司]进行原位酶切，标准分子质量用布伦登卢普沙门菌H9812（Salmonella braenderup H9812）的Xba Ⅰ[宝生物工程（大连）有限公司]酶切指纹谱带。PFGE仪CHEF MAPPER（美国BIO-RAD）电泳19 h后，Gelred（北京索莱宝科技有限公司）染胶，利用凝胶成像系统Gel DoC^TM（美国BIO-RAD）读胶保存。

将菌株PFGE指纹图谱、血清型、毒力基因谱以及菌株分离相关信息导入Bionumerics 6.6软件（Applied Maths，比利时）VP分子分型数据库。在分析相似度时，用Clustering功能对菌株的指纹图谱进行聚类，聚类相似系数（距离）采用基于条带的Dice差异，利用非加权组平均法（UPGMA）分析。

10株菌株可分5种血清型，其中O3:K6型6株；其他4株分别为O4:K8、O1:KUT、O2:KUT和O10:K19（图 1）。

图 1 NotⅠ和SfiⅠ酶切脉冲场凝胶电泳图谱聚类分析 Figure 1 PFGE patterns of isolates with enzyme Not Ⅰ and Sfi Ⅰ digestion 注：致病株为VP500、VP501、VP502、VP503、VP506、VP507、VP509；非致病株为VP504、VP505、VP508；“大流行株”为VP500、VP501、VP503、VP507、VP509

图选项

所有分离株tlh基因均为阳性，trh基因均为阴性。不同血清型VP携带tdh基因情况有所不同，O3:K6和O4:K8株均为阳性，其他血清型tdh基因均为阴性。对于ORF8基因，有5株O3:K6株为阳性，其他5株为阴性。值得注意的是，菌株VP502血清型也为O3:K6但ORF8基因呈阴性（图 1）。

分离株经PFGE凝胶成像后，运用Bionumerics 6.6软件进行聚类分析。10株VP分离株分为8个不同型别（图 1），VP501、VP502和VP507具有相同型别，三者相似度为100%。其余菌株条带至少存在≥1条的差别，各为1个菌型。由聚类图可以看出，6株O3:K6血清型VP相似度较高，聚为一簇，相似度>91.3%。

该起VP集中暴发事件与食用被污染食物密切相关，据调查，丧宴中的海产品对虾为高度怀疑的污染源头，但因未进行留样，故无法从食品上检出VP。另外提示对虾为污染来源的依据为，从就医患者中的1名5岁小男孩粪便标本中分离出VP（编号为VP504），但该儿童并未出席丧宴，仅食用由家人打包的对虾（未带其他食物），也同样腹泻并分离出VP。由聚类图可以看出，VP504的PFGE型别与其他患者分离株差别较大，未携带tdh和trh毒力基因。因此，该株菌的致病性及其在该暴发事件中的作用待进一步论证。

VP在各类海产品或海底沉积物中广泛存在，且通常为多种菌型的共生状态，1份标本可分离数种血清型VP。因此，一旦食物被污染，也将是各菌型VP共感染的结果。在调查VP感染时，本实验室结合菌株的血清型，tlh、tdh、trh、ORF8基因携带情况，Not Ⅰ和Sfi Ⅰ两种酶切后的PFGE带型进行综合分析。仅以上特征完全相同时才将这些菌株定义为“相同菌型”或“同一株菌”。在该次感染暴发事件中，虽菌株VP502与VP501、VP507均为O3:K6血清型，PFGE指纹图谱经Bionumerics 6.6软件分析结果也相同，但通过肉眼仔细辨认可以发现，VP501和VP507菌株由左侧第7、8条条带开始明显地分开，而VP502相同位置的2条带合在一起，且VP502的ORF8基因为阴性，VP501和VP507的ORF8基因呈阳性，基于此，我们认为VP502菌型与VP501和VP507不同，属于2个不同菌型。鉴于VP菌型具有多样性，在开展调查流行病学调查时，应从同一份标本中尽可能挑取多个可疑菌株，同时运用多种分型手段结合流行病学资料进行分析，以更全面地掌握流行株菌型和特征。而实际工作中，基层疾病预防控制机构却疏于菌型分析，仅以VP污染上报。该起集中暴发事件也存在该问题，每份标本仅保存1株菌，未能鉴别1份标本中是否存在多种菌型，在今后工作中应完善。

由该起暴发事件看出，按血清型、毒力基因型和PFGE型来说分别为5、3和8种，同为O3:K6血清型菌株可以分出4种PFGE型别，因此，PFGE分型最为敏感，在VP流行调查中不失为一种有效方法。VP主要毒力因子有耐热直接溶血素（TDH）和相关溶血素（TRH），其分别由tdh和trh基因编码，通常将携带有其中1个或2个基因的VP称为致病株。而在本次暴发中，由腹泻患者肛拭子分离的3株菌并未携带这2个基因，虽其致病力有待进一步研究，但提示该种“非致病菌株”在日常监测中也不能完全忽视。20世纪90年代末，以O3:K6为代表携带tdh和ORF8基因的VP在全球范围内导致发病率急剧增加^[9-11]。在该起暴发分离株中，有5株VP具有相同特征，是“大流行株”克隆群，为感染暴发的主要菌群，与国内大多数研究相似^[12-13]。值得注意的是，虽VP502血清型为O3:K6，tdh基因呈阳性，但ORF8基因呈阴性，故该株不属于“大流行株”抑或是“大流行株”变种。但无论何种情况，该起暴发事件及之前较多报道均提示，VP感染往往是多菌型，有效预防须从源头上将生熟食物严格分开，避免食物被污染^[14-15]。

综上所述，VP菌群繁多，开展调查时应多挑取可疑菌落，并运用多种分型手段以更准确地分析暴发流行情况。本暴发事件是由一群多种血清型、多PFGE型别的致病和非致病VP共同引起。

作者贡献:

王红  ORCID：0000-0001-6561-8336

王红：文章撰写，PFGE实验

何德辉：菌株分离保存

杜悦、苏爱荣、蓝兰：菌株鉴定与血清 实验

赵鹏、李秀桂：现场调查，数据分析

黄彦：实验设计，技术支持