2018, Vol. 33扩展功能
文章信息
- 李方, 夏依旦·吾甫尔, 周海健, 刁保卫, 木塔里甫·托呼提, 张建, 马合木提
- Li Fang, Xiayidan·wufuer, Zhou Haijian, Diao Baowei, Mutalifu·tuohuti, Zhang Jian, Mahe Muti
- 1995-2016年新疆维吾尔自治区伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳分子分型分析
- Pulsed field gel electrophoresis based molecular typing of Salmonella typhi in Xinjiang, 1995-2016
- 疾病监测, 2018, 33(5): 402-406
- Disease Surveillance, 2018, 33(5): 402-406
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.05.012
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文章历史
- 收稿日期：2018-02-05
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206
2. State Key Laboratory of Communicable Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
伤寒是由伤寒沙门菌（Salmonella typhi）引起的全身系统性疾病。近年来，新疆维吾尔自治区（新疆）伤寒/副伤寒发病总体呈下降趋势，但2011年报告发病率仍居全国第3位[1]。新疆喀什地区每年均有伤寒病例报告，作为伤寒/副伤寒的老疫区，其发病水平依居全国前列[2]。新疆地区 > 90%伤寒病例发生在喀什地区。为调查新疆伤寒沙门菌的型别及流行特征，本研究对1995－2016年分离的527株伤寒沙门菌进行脉冲场凝胶电泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型，揭示其分子流行特征，为今后疫情预警和暴发处置提供依据。
1 材料与方法 1.1 菌株来源1995－2016年新疆细菌性腹泻病监测中分离527株伤寒沙门菌。菌株分离信息见表 1。
| 年份 | 喀什地区 | 和田地区 | 吐鲁番地区 | 哈密地区 | 伊犁州 | 塔城地区 | 乌鲁木齐市 |
| 1995 | 3 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1996 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 |
| 1997 | 3 | 0 | 0 | 0 | 5 | 3 | 0 |
| 1998 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1999 | 5 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2000 | 8 | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2001 | 4 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2002 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2003 | 12 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2004 | 18 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 2005 | 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2006 | 94 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2007 | 105 | 1 | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2008 | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2009 | 68 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2010 | 53 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2011 | 5 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2012 | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2013 | 16 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 3 |
| 2014 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2015 | 31 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2016 | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 合计 | 480 | 21 | 9 | 5 | 6 | 3 | 3 |
伤寒沙门菌PFGE分型方法使用国家致病菌识别网推荐的标准化方案，关键参数：适用浊度仪（Biomerieux公司）调整细菌悬液浓度，使浊度为3.8~4.0；400 μl细菌悬液加入20 μl浓度为20 mg/ ml的蛋白酶K（德国MERCK公司）再加入等量的1%SeaKemGold（瑞士Lonza公司）混匀倒入模具制作胶块；通过25 μl蛋白酶K裂解菌体细胞；使用45 U XbaⅠ（TaKaRa公司）进行酶切；在CHEF-MAPPER（Bio-Rad Laboratories公司，美国）电泳仪中进行PFGE；电泳参数为2.16~ 63.8 s，19 h。胶块电泳后使用GelRed染色，纯水脱色，凝胶成像仪（BIO-RAD Gel Doc XR+）读取图谱。PFGE的分子质量标准菌株为沙门菌H9812。
PFGE图像录入BioNumerics（Version 7.1，Applied maths公司，比利时）软件包进行处理，识别图像条带，经统一的分子质量标准进行校准，标定条带位置，必要时进行手工校正，＜2.05×104 bp的条带忽略不计。每两个图像间的相似性系数采用Dice系数（Dice coefficients，SD）表示。SD值反映不同菌株PFGE图像间的相似性程度，范围在0~1之间，0代表完全不同，1代表完全相同。出现不同条带即判定为不同型别，对每个型别均进行命名。根据每两个图像间的相似性系数，用非加权配对算术平均法（unweighted pair group average method，UPGMA）进行聚类，构建聚类树。
2 结果 2.1 带型时间和地区分布527株伤寒沙门菌经XbaⅠ酶切和电泳后，分为145个不同带型，相似度为57.42%~100.00%。菌株数>1株的带型有65个，占全部带型的44.83%。
在145个带型中，有135个带型只出现在1个地区；其余10个带型出现在2个地区，其中7个带型（SAX01. XJ001、SAX01. XJ006、SAX01. XJ089、SAX01. XJ231、SAX01. XJ237、SAX01. XJ255、AX01. XJ295）出现在喀什及和田地区，2个（SAX01.XJ027、SAX01. XJ090）出现在喀什地区和伊犁州，1个（SAX01.XJ313）出现在喀什和哈密市。乌鲁木齐、吐鲁番市和塔城地区的菌株带型均只在本地检出（图 1）。在145个带型中，有108个只出现在1个年份；其余37个带型在≥2个年份出现。其中SAX01. XJ001出现的年份最多，在17个年份中被检出，其中包括2003－2016年连续14年（图 1）。
对145个带型中菌株数>10株的10种带型进行分析。10个带型的菌株占全部菌株的52.75%（278/ 527），其中除2011年2株菌（带型为SAX01.XJ001）和2001年1株菌（带型为SAX01.XJ0089）分离自和田地区洛浦县外，其余275株均分离自喀什地区。喀什地区各县每年优势带型不同，如麦盖提县2006年带型主要为SAX01. XJ258（15株），至2007年则转变为SAX01.XJ026（36株）；伽师县在2006年带型为以SAX01. XJ260（7株）和SAX01. XJ001（6株）为主，2007年则转变为SAX01. XJ013（11株）和SAX01. XJ234（8株）。在这10个带型中，除SAX01.XJ0001、SAX01.XJ0089外，其他8个带型均只出现在2012年前。菌株数最多的带型SAX01.XJ001在17个年份有检出，且在喀什地区伽师县有10个年份检出，2013年起仅在伽师县检出。带型SAX01.XJ0026主要出现在麦盖提县，有45株菌分离自麦盖提县，SAX01.XJ0258仅在2006年出现在麦盖提县（图 1）。
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| 图 1 菌株数大于1株的65个脉冲场凝胶电泳带型聚类图 Figure 1 Sixty five PFGE types with more than 1 strains |
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本研究中确定1个月内在同一县（市）出现PFGE带型相同的病例数≥3个为聚集性病例。通过分析，1995－ 2016年中有13年出现了聚集性病例事件，共32起（表 2）。其中2006和2007年最多，分别有8和7起；其余年份有1~3起。共在9个县（市）检出，其中喀什地区伽师县最多，达15起；其余县（市）各自检出1~4起不等。共有23种带型引起分子分型聚集性病例，其中SAX01.XJ0001引起最多（6起）、其次为SAX01.XJ0026（3起）。
| 带型编号 | 菌株数 | 分离时间(年.月) | 分离地区 |
| SAX01.XJ0255 | 4 | 1995.10 | 和田地区洛浦县 |
| SAX01.XJ0001 | 4 | 1998.8 | 喀什地区岳普湖县 |
| SAX01.XJ0275 | 4 | 2000.8 | 喀什地区岳普湖县 |
| SAX01.XJ0247 | 4 | 2000.10 | 和田地区洛浦县 |
| SAX01.XJ0284 | 3 | 2004.8 | 喀什地区巴楚县 |
| SAX01.XJ0299 | 3 | 2004.9 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0312 | 3 | 2004.8—9 | 喀什地区英吉沙县 |
| SAX01.XJ0001 | 3 | 2006.8—9 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0026 | 4 | 2006.8 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0026 | 8 | 2006.9—10 | 喀什地区麦盖提县 |
| SAX01.XJ0052 | 3 | 2006.8 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0258 | 15 | 2006.9 | 喀什地区麦盖提县 |
| SAX01.XJ0260 | 7 | 2006.9 | 喀什地区英吉沙县 |
| SAX01.XJ0260 | 6 | 2006.8—9 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0265 | 3 | 2006.9 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0013 | 11 | 2007.8—9 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0026 | 36 | 2007.5—9 | 喀什地区麦盖提县 |
| SAX01.XJ0223 | 11 | 2007.7—9 | 喀什地区岳普湖县 |
| SAX01.XJ0234 | 5 | 2007.7—8 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0245 | 6 | 2007.9 | 吐鲁番市 |
| SAX01.XJ0246 | 3 | 2007.9 | 吐鲁番市 |
| SAX01.XJ0249 | 3 | 2007.7 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0010 | 4 | 2008.7 | 喀什地区岳普湖县 |
| SAX01.XJ0001 | 43 | 2009.5—10 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0004 | 4 | 2009.6 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0032 | 19 | 2010.8—9 | 喀什地区莎车县 |
| SAX01.XJ0034 | 7 | 2010.9—10 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0013 | 3 | 2012.7 | 喀什地区泽普县 |
| SAX01.XJ0001 | 9 | 2013.7—8 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0001 | 20 | 2015.5—8 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0089 | 3 | 2015.5 | 喀什地区伽师县 |
| SAX01.XJ0001 | 4 | 2016.8 | 喀什地区伽师县 |
有13起疫情持续时间>1个月，其余19起 < 1个月。其中2009年在喀什地区伽师县由SAX01. XJ0001引起的聚集性病例时间跨度最长，为5－ 10月份，分离菌株43株；其次为2007年在喀什地区麦盖提县由SAX01.XJ0026引起的聚集性病例，时间跨度5－9月，分离菌株36株；再次为2015年在喀什地区伽师县由SAX01.XJ0001引起的聚集性病例，时间跨度5－8月份，分离菌株20株。32起聚集性事件中，仅有3起被发现并报告，分别为2007年吐鲁番市（带型为SAX01. XJ0245和SAX01. XJ0246）、2010年莎车县（带型为SAX01.XJ0032）和2012年泽普县（带型为SAX01.XJ0013）暴发事件（表 2）。
3 讨论PFGE分型技术作为分子分析的“金标准”，通过分型鉴定菌株是否一致，在细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查及识别暴发中有重要意义[3]。本次研究通过PFGE技术分析1995－2016年新疆地区监测所得伤寒沙门菌，以发现其流行特征。
因本研究为回顾性分析，部分年份菌株无法复苏，导致有些年份菌株数量过少，甚至缺失且近年来伤寒在新疆的发病率日趋下降[4]，所研究菌株数量有限，可能存在一定局限性。但以现有资料分析，527株伤寒菌分为145个带型，说明菌株基因存在多样性。马宏等[5]研究235株伤寒菌分为69个带型也说明了该结论，但又有带型SAX01.XJ001多年在一个地区长期存在，说明此带型具有稳定性。田克诚等[6]对贵州省1959－2006年伤寒沙门菌PFGE研究发现，既有基因多态性也有优势带型长期连续出现。
喀什地区是新疆伤寒老疫区，也是伤寒病例最多的地区，研究中91.08%菌株来自喀什地区，带型具有相同特点，137个带型均在喀什地区菌株中出现，且主要集中在伽师县。新疆各地分离株带型具有一定独立性，有地域特征，乌鲁木齐市、吐鲁番市和塔城市均只在本地出现，未传入其他地市。有9个带型在不同的2个地区出现，说明菌株可能存在跨地区传播。
对表 2中前10个带型进行分析发现，8个带型相似度 > 86.2%，根据Tenover等[7]提出对结果的判定和Talon等[8]对结果的解释认为 > 85%相同条带的菌株为来源相同的菌株来看，该8个带型菌株除2株外均来自同一喀什地区，则认为这些菌株可能具有同一来源。自1995年检出的SAX01.XJ001带型主要集中在伽师县，且自2013年起仅在伽师县检出，可认为SAX01.XJ001带型在伽师县一直稳定存在，且可能是导致伽师县伤寒流行的原因之一。
本研究通过对新疆地区既往分离的伤寒沙门菌进行分子分型，根据1个月内在同一县（市）出现PFGE带型相同的病例数量≥3个考虑为聚集性病例。确定32起分子分型聚集性病例，但在查询监测资料时发现，其中仅3起在日常病例监测中按暴发疫情被发现并报告，13起持续时间 > 1个月的聚集性病例仅有1起被发现并报告，说明根据病例的暴发监测遗漏了大部分聚集性病例，今后应对实验室监测数据及时分析，提高暴发和聚集性病例的发现及检出。
3起被发现的暴发疫情有54株分离菌，3起暴发事件均在病例中检出相同PFGE带型菌株。2007年吐鲁番市暴发的带型SAX01. XJ245和SAX01. XJ246菌株仅在本次暴发中检出，2010年莎车县暴发的SAX01.XJ0032带型菌株也除1998年在叶城县检出1株外也只在本次暴发中检出，且刘清等[9]和Yan等[10]对该两起暴发研究均发现，引起两起暴发事件的菌株均为多重耐药菌。研究发现，暴发疫情中菌株大多具有同一来源，同时也提示暴发蔓延时间长，病例多可能与菌株多重耐药有关，提示我们在今后若发现与该两起暴发事件相同带型的菌株应提高警惕，以防疫情再次发生。
PFGE技术虽具有仪器昂贵、试验周期长等缺点，但其操作程序标准化且结果重复性好，易于在各网络实验室间比对，实现信息共享，已广泛应用于细菌性传染病的分子流行病学工作。本研究对新疆地区历年伤寒沙门菌进行PFGE分型，初步建立本地沙门菌PFGE数据库，以期为今后细菌性监测和疫情处置提供借鉴。
志谢: 新疆参与腹泻病监测的所有同仁为菌株鉴定提供帮助，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所对实验给予大力支持！作者贡献:
李方 ORCID：0000-0002-3284-1571
李方：PFGE实验，数据分析，论文撰写
夏依旦·吾甫尔：菌株鉴定
周海健：数据分析，论文修改
刁保卫：PFGE实验
木塔里甫·托呼提：菌株鉴定
张建：PFGE实验
马合木提：技术指导，论文修改
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