鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌）引起的一类人兽共患自然疫源性疾病，历史上数次大流行将鼠疫菌传播到世界各地，给人类社会带来巨大灾难^[1]。我国鼠疫自然疫源地面积广阔，类型多样，分布在至少全国19个省份的305个县（市、旗）^[2]。目前，青藏高原已发现两种类型鼠疫自然疫源地，即1954年发现的喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地和1997年发现的青海田鼠鼠疫自然疫源地^[3-5]。其中，喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地分布在青海、西藏、甘肃、新疆维吾尔自治区（新疆）地区的75个县（市）。青海田鼠鼠疫自然疫源地分布在四川省石渠县和青海省称多县。

目前，大多鼠疫菌基因组已经测序完成，其中包括1株分离自青藏高原那曲地区的喜马拉雅旱獭疫源地菌株Z176003 ^[6]，既往Shen等^[6]研究将世界范围内8株已测序的鼠疫菌进行比对，将鼠疫菌的基因组划分成61个板块，并用61个板块缺失和排列的特征对鼠疫菌进行分型发现，菌株Z176003缺失了一段独特的序列。利用BLAST软件将Z176003菌株与61个板块比对发现，Z176003缺失序列即编号第59号板块，且发现在该菌株中第58号板块发生了位移，致使在该菌株中第57板块与第60板块直接相连^[7]。为确定该缺失是否为那曲、比如地区鼠疫菌的共同特有特征，本研究采用了板块重排、差异区段分析（different region，DFR）、间区规律短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）、多位点可变数目串联重复序列分析（multiple - locus variable - number tandem repeat analysis，MLVA）4种基于PCR技术的分子分型方法对所有分离自那曲、比如地区的青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地菌株，以及一些分离自青藏高原和四川省、云南省鼠疫自然疫源地的98株鼠疫菌进行基因组分型研究和比较，确定该类型菌株在我国的地理分布。

选取1954-2012年分离自青藏高原地区的98株鼠疫菌代表菌株，其中76株菌分离自喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，19株鼠疫菌分离自青海田鼠鼠疫自然疫源地，3株分离自云南省剑川和玉龙鼠疫疫源地。菌株分离地见图 1。

图 1 98株鼠疫菌的地理分布 Figure 1 Geographic distribution of 98 Y. pestis strains

图选项

采用以PCR技术和序列测定为核心的板块重排、CRISPR、DFR、MLVA 4种鼠疫菌型别鉴定方法。在Z176003全基因组序列的基础上利用Primer 5.0软件对第57、58、59、60板块的连接部位进行引物设计，并用已测序菌株验证引物。重排研究引物信息见表 1。CRISPR、DFR、MLVA引物序列依次参照文献[8-10]，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

利用BioNumerics V5.10软件，采用效用均等的分类资料分析方法（Unweighted Pair Group Method with Arithmeticmeans，UPGMA）对数据进行分析。应用MLVA（14+12）方法的26个指标聚类时，为加强该分级分型法中14个低变异度指标在鼠疫种群中的区分能力，减弱高变异度的12个指标对聚类关系的影响，将第一级分型14个指标的权重设为2，用于种内溯源分析的12个指标权重设为1。

1976-2012年分离自西藏自治区（西藏）那曲和比如地区的9株鼠疫菌（包括所有收集菌株）的扩增结果全部与测序菌株Z176003一致，表明第57与60板块相连，该特殊排列模式在那曲和比如地区的菌株中比较普遍。而分离自其他地区的鼠疫菌未发现与Z176003菌株一致的扩增结果，说明该板块排列模式为那曲和比如地区菌株所特有的排列模式，见表 2。

98株菌应用MLVA（14+12）方法的26个指标聚类，为区分该策略中14个低变异度指标在鼠疫种群中的区分能力，这14个指标权重设为2，另外12个指标权重设为1。聚类结果显示，98株实验菌株在基因型上被分为4大类，对比菌株的分离地点发现，4类基因型分别分布在青藏高原的冈底斯山一带、祁连山一带、那曲地区、称多和石渠地区，为4个青藏高原田鼠鼠疫疫源地的亚型。在实验中，那曲和比如地区的菌株前14个数目可变串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）位点的重复数相同且与Li等^[10]实验结果一致，在后12个VNTR位点中，M22、M34、N1606、N2117位点的重复数发生了变化，减少或增加了1~5个重复数不等，说明菌株在传入那曲和比如地区后持续进化，VNTR位点在不断突变。

DFR方法与板块重组相似，利用23对引物对菌株进行分型，将98株菌分为9种型别，其中那曲和比如地区的菌株被分为单独一类，即G06型别。其他实验菌株分别为G05、G07、G08、G10、G14等多种型别^[11]。G14型主要分布在称多和石渠的田鼠鼠疫疫源地，G10型主要分布在冈底斯山型疫源地，G08型分布在祁连山型鼠疫疫源地，G07和G05型分布在祁连山和巴颜喀拉山一带的鼠疫疫源县。将DFR实验阴性结果的扩增片段与板块排列中缺失的第59板块的序列进行了比对显示，DFR14和DFR22扩增的产物与第59板块有重合。

CRISPR序列在98株实验菌株中对应YPa、YPb和YPc，有9种排列（型别），见图 2。其中，那曲和比如地区的CRISPR排列为在3个位点排列依次为a1- a2-a3-a4-a5-a6-a7、b1-b2-b3-b4、c1-c2-c3。与包括青海省的10株、四川省的4株、云南省的1株、西藏的5株鼠疫菌的CRISPR类别一致，CRISPR方法不能区分那曲地区菌株。

图 2 98株菌MLVA（14+12）聚类结果 Figure 2 Phylogenetic tree of 98 Y. pestis strains by MLVA(14+12) 注：DFR和CRISPR的实验结果作为菌株信息呈现在图中

图选项

随着基因组学技术的发展，多种分析技术被应用于鼠疫菌的分析研究，各技术均有其优势和缺点^[12]。鼠疫菌的染色体和质粒中存在大量掺入序列（IS），如IS100、IS1661、IS1541、IS285。这些插入序列占整个鼠疫基因组的3.7%（以CO92为例）。使鼠疫菌染色体DNA具有高度的可塑性，重组、片段获得和缺失、基因失活等现象普遍。板块重排指鼠疫菌染色体中DNA区段的排列顺序和方向发生变异，导致不同区段中所载荷基因的位置、功能及相互关系的变化^[13]。鼠疫菌染色体的61个板块相对独立，板块内部基因排列十分稳定，而板块间的相对位置在不同菌株的染色体上各不相同^[7]。这些特征可被用于鼠疫菌的种群结构研究。DFR为细菌基因组在进化过程中表现出存在或缺失的片段，这种存在或缺失反映出鼠疫菌在进化过程中横向基因的转移情况。鼠疫菌基因组包含23个差异片段，基于此基因组型的分布具有明显的疫源地特异性，多数疫源地拥有占优势数量的基因组型，可用于鼠疫菌种群关系和微进化分析，反映鼠疫菌在自然界适应性进化及其与生态适应的关系^{[9, 11, 14]}。这两种分型方法实际说明的是一类性质的问题，即由插入序列引起的DNA大片段的缺失和重排。既往单核苷酸的多态性（SNP）研究认为那曲和比如地区的菌株型属于古典型鼠疫菌1.IN群^[15]。本研究那曲和比如菌株缺失的第59板块位于CO92全基因组序列4565718~4610718位置，全长45 001 bp，上游插入序列和下游插入序列均为IS1661。可能是导致板块消失的原因之一。59板块内包含33个基因，其基因产物有二元调控系统、氨基酸酶、调控蛋白、膜蛋白、糖转运蛋白、离子转运系统、菌毛蛋白和木酮糖激酶等^[16]。

DFR方法用23个差异片段可以很好地区分鼠疫菌的多种基因型别，在灵活度、精确度上优于板块重排方法，但板块重排可能通过更少的扩增来判定基因型别，其应用需进一步研究。

CRISPR为一类有同向重复序列（direct repeat，DR）和将其分隔开的间区序列（spacer）构成的重复序列，广泛分布于原核生物基因组中。CRISPR位点可作为细菌分型和进化分析的理想分子靶标^[17]。鼠疫菌基因组中存在3个CRISPR位点，CRISPR位点的spaces分布可用于鼠疫菌的分型研究^{[8, 17]}，该方法操作简单快速、结果稳定、重现性好。本研究CRISPR方法将98株菌分为9种类型，来自于四川石渠和青海称多的青海田鼠型菌株单独为一个型别，但那曲和比如地区菌株的间区序列的分布未能与其他同西藏同群的36株菌区分，该方法对于菌株的分辨力不如DFR法。

MLVA通过区分基因组上多个具有多态性的VNTR的重复数来区分不同菌株。国内杨瑞馥^[12]团队发展的MLVA（14+12）测序利用两组VNTR的组合，即利用14个变异度低的指标组合（MLVA14）对鼠疫种群进行划分，其分类效果类同于基因组SNP分型方法，另增加12个高变异度的VNTR指标（MLVA12）可用于鼠疫菌的溯源调查，因简便快捷，适合鼠疫监测实验室开展溯源调查。本研究中，该方法将实验菌株分为4大类，与菌株的地理分布一致，即冈底斯山型、青海田鼠型、祁连山型和那曲比如型。在每类中，菌株又分为许多亚种，该分型方法非常精准，其结果可用于观察同类别菌株的细微遗传进化差别。那曲和比如等多地菌株均有再进化现象，呈现遗传多态性。

就那曲和比如地区的菌株而言，有其独特的基因型别，可能归因于该疫源地菌株的特殊地理占位，该地区地处念青唐古拉山脉与唐古拉山脉交汇处，高山阻断使该地区的菌株在一次偶然传入后，经过自然选择，形成了适应该地区的基因型别，该型别很难输出，也很难有外来菌株再次偶然传入，久而久之其地理局限性导致该地区菌株特有的基因型稳定遗传，并保守在地区内，可见地理特征对菌株的基因型分布有一定的划分和阻断作用，更多基因型与地理特征关系需更多研究验证。

作者贡献:

王宇萌  ORCID：0000-0002-2651-665x

王宇萌：实验操作，数据分析，文章撰写

梁莹、张恩民、马娜、申小娜、蔡虹、张志凯：实验操作与数据分析技术指导

夏连续、梁未丽：论文写作指导

代瑞霞、李伟：课题经费资助