2018, Vol. 33扩展功能
文章信息
- 黄世腾, 杨瑞军, 吕磊, 陈旭富, 叶承华, 万圣
- Huang Shiteng, Yang Ruijun, Lyu Lei, Chen Xufu, Ye Chenghua, Wan Sheng
- 2015-2017年浙江省衢州市H3N2亚型流感病毒血凝素基因分子进化特征分析
- Molecular characteristics of hemagglutinin gene of influenza A(H3N2)virus in Quzhou, 2015-2017
- 疾病监测, 2018, 33(6): 483-488
- Disease Surveillance, 2018, 33(6): 483-488
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.06.010
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文章历史
- 收稿日期：2017-12-26
血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuramindase，NA）基因是流感病毒基因片段中变异频率最高的两个基因，其编码的HA和NA也是流感病毒主要的两种抗原，目前发现有HA亚型18种（H1~H18）和NA亚型11种（N1~N11）[1]；其中，HA作为流感病毒的主要表面抗原，在病毒与宿主受体识别过程中起着重要作用，是宿主是否可被病毒感染的先决条件；并且其基因变异不仅能够改变其宿主特异性，从而实现跨物种间转播，同时由于其抗原性不断变异，使病毒实现免疫逃逸，导致流感病毒能够不断引起流行。在过去的数十年间，甲型流感病毒曾多次引发全球疫情，其中，H1N1和H3N2是最主要的型别[2-4]，给人类健康造成严重危害。通过近年来的监测数据显示，2013年以来衢州市H3N2亚型一直处于优势流行状态，冬春季节为流行高峰，并且在2017年3月和8月出现双峰流行；本研究选取衢州市2015-2017年具有代表性的H3N2亚型流感病毒18株，对其HA基因序列的分子进化特征进行分析，了解病毒的变异趋势，旨在为流感的防控提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本来源收集2015年1月至2017年12月由衢州市流感监测哨点医院（衢州市人民医院）每周采集发病3 d内未使用抗病毒药物的流感样病例（ILI）鼻咽拭子标本；具体标准及相关方法参照《全国流感监测方案（2010年版）》 [5]。
1.1.2 主要试剂MagMAXTM - 96 Viral RNA Isolation Kit（批号：00324778）核酸提取试剂盒购自ABI公司，One - step PrimeScriptTMRT - PCR（批号：AK7801）试剂盒购自TaKaRa公司，MEM培养液、胎牛血清及TPCK-胰酶均购于GIBCO公司。
1.2 方法 1.2.1 病毒分离与鉴定核酸检测为阳性的标本，接种至MDCK细胞进行流感病毒的分离，分离毒株采用红细胞凝集试验和凝集抑制试验进行鉴定[5]。
1.2.2 HA基因PCR扩增及测序选取不同时间段的H3N2亚型流感毒株18株，采用核酸提取试剂盒提取病毒核酸；HA基因的PCR扩增采用One-step RT-PCR进行，扩增引物及反应条件参照文献[6]，引物由上海伯杰生物科技有限公司合成，扩增产物经纯化后送上海伯杰生物科技有限公司进行双向测序。
1.2.3 HA基因分析测序结果通过DNAStar V7.10生物软件中的SeqMan进行拼接，获得HA基因全长序列，利用MEGA 6.0软件将分离毒株序列与世界卫生组织推荐的北半球2015-2016年度流感疫苗株A/Switzerland/9715293/2013和2016-2018年度流感疫苗株A/Hong Kong/4801/2014（北半球2016-2017年度疫苗株，也是2017-2018年度疫苗株）进行核苷酸和氨基酸比对分析，并构建HA基因系统进化树；利用在线分析软件NetNGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc）对HA的氨基酸序列进行糖基化位点分析。H3N2疫苗株及相关代表毒株的HA基因序列均来自GISAID和GenBanK。
2 结果 2.1 病毒分离结果2015年1月至2017年12月衢州市流感网络实验室共分离出流感病毒150株；各年度分离毒株数分别为36、44和70株，其中甲型H3N2毒株数分别为22株（61.11%）、18株（40.91%）和37株（52.86%）；3个年度中，甲型H3N2均为优势毒株，并且在2017年夏季保持在较高水平流行，呈现明显流行高峰。
2.2 同源性分析选取的18株H3N2亚型流感病毒HA基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.36%~100.00%和96.76%~100.00%，2015年分离株与WHO推荐的北半球2015-2016年度疫苗株A/ Switzerland/9715293/2013核苷酸和氨基酸同源性分别97.96%~99.82%和97.85%~100.00%，2016年和2017年分离株与北半球2016-2018年度疫苗株A/ Hong Kong/4801/ 2014核苷酸和氨基酸同源性分别为98.63%~99.47%和98.39%~99.82%。2015-2017年分离株与同年度疫苗株HA基因的核苷酸平均遗传距离分别为0.008 2、0.007 1和0.011 2，氨基酸平均遗传距离分别为0.009 2、0.003 1和0.010 0。
2.3 HA基因进化分析对分离的18株H3N2亚型流感病毒HA基因序列构建系统进化树（图 1），发现2015-2017年选取的分离株均属于3C系，但支系发生了分化，从2015年的3C.3a支系，逐渐转变为3C.2a支系；其中，2015年分离的6株毒株中前期4株为3C.3a支系，后期2株（A/Zhejiangkecheng/1591/2015和A/Zhejiangkecheng/1692/2015）为3C.2a支系，与同期2015-2016年度疫苗株A/Switzerland/9715293/ 2013（3C.3a支系）的遗传距离较远；2016年和2017年分离株与疫苗株A/Hong Kong/4801/2014均为3C.2a支系，但相比2016年，2017年分离株与疫苗株A/ Hong Kong/4801/2014的平均遗传距离相对较远。
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| 图 1 2015－2017年衢州市H3N2亚型流感病毒HA基因系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree of HA genes of influenza A(H3N2)virus in Quzhou 2015-2017 |
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18株H3N2亚型流感病毒分离株HA基因序列全长均为1 701 bp，编码566个氨基酸；其HA蛋白氨基酸序列与同年度疫苗株比较，变异位点共涉及流感病毒HA蛋白的5个抗原表位（包括A、B、C、D和E区），其中变异频率较高的位点主要有N121K、T131K、R142G/S/K、S144N/K和R261Q（按去信号肽序列排序）。2015年分离的6株毒株与2015 - 2016年度疫苗株A/Switzerland/9715293/2013对比，同时存在2株及以上毒株的氨基酸位点变异有11处，9处位于HA1区，2处位于HA2区，其中抗原表位变异位点涉及有A（S138A、G142S/R、N144S）、B（A128T、S159Y、K160T）及C（Q311H），并且同时涉及3个抗原表位的有2株；2016年和2017年分离的12株毒株与2016-2018年度疫苗株A/Hong Kong/4801/2014对比，同时存在2株及以上毒株的氨基酸位点变异有14处，12处位于HA1区，2处位于HA2区，其中抗原表位变异位点涉及有A（T131K、T135N/K、R142K/G、S144K、R150K）、B（S198P）、C（H311Q）、D（N121K、N171K）和E（K92R、R261Q），并且包括受体结合位点T131K和T135N/K，同时涉及5个抗原表位的有2株，涉及3个抗原表位的有4株（表 1）。
| 毒株名称 | 基因分支 | 抗原表位 | |||||||||||||||||||||||||
| A | B | C | D | E | |||||||||||||||||||||||
| 124 | 131a | 135a | 138 | 142 | 144 | 150 | 128 | 159 | 160 | 198 | 48 | 50 | 304 | 311 | 121 | 171 | 62 | 81 | 88 | 92 | 261 | ||||||
| A/Hong Kong/4801/2014 | 3C.2a | S | T | T | A | R | S | R | T | Y | T | S | I | E | A | H | N | N | E | N | V | K | R | ||||
| A/Switzerland/9715293/2013 | 3C.3a | S | T | T | S | G | N | R | A | S | K | S | I | E | A | Q | N | N | E | N | V | K | R | ||||
| A/JiangsuChongchuan/18/2016 | 3C.2a | S | I | T | A | R | S | R | T | Y | T | S | I | E | A | H | N | N | E | N | V | K | R | ||||
| A/ShanghaiHuangpu/1818/2017 | 3C.2a | S | K | T | A | K | R | R | T | Y | T | S | I | E | A | H | N | N | E | N | V | K | Q | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1202/2015 | 3C.3a | - | - | - | S | G | N | - | A | S | K | - | - | - | - | Q | - | - | G | - | - | - | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1218/2015 | 3C.3a | - | - | - | S | G | N | - | A | S | K | - | T | - | - | Q | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1227/2015 | 3C.3a | - | - | - | S | G | N | - | A | S | K | - | - | - | - | Q | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1572/2015 | 3C.3a | - | - | - | S | G | N | - | A | S | K | - | - | - | - | Q | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1591/2015 | 3C.2a | - | K | - | - | S | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1692/2015 | 3C.2a | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1980/2016 | 3C.2a | - | K | - | - | K | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1118/2017 | 3C.2a | - | K | - | - | K | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | Q | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1135/2017 | 3C.2a | - | K | - | - | K | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1649/2017 | 3C.2a | - | K | - | - | K | - | - | - | - | - | - | - | K | - | - | - | - | - | - | - | - | Q | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1680/2017 | 3C.2a | - | - | N | - | - | - | - | - | - | - | P | - | - | - | Q | K | K | - | - | - | R | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1771/2017 | 3C.2a | - | - | N | - | - | - | - | - | - | - | P | - | - | - | Q | K | K | - | - | I | R | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1790/2017 | 3C.2a | - | K | - | - | K | - | - | - | - | - | - | - | - | T | - | - | - | - | - | - | - | Q | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1841/2017 | 3C.2a | R | - | K | - | G | K | K | - | - | - | - | - | - | - | - | K | - | - | - | - | - | Q | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1854/2017 | 3C.2a | - | - | K | - | - | K | K | - | - | - | - | - | - | - | - | K | - | - | D | - | - | Q | ||||
| 注：氨基酸对比参照株A/Hong Kong/4801/2014；a表示受体结合位点 | |||||||||||||||||||||||||||
糖基化在病毒致病和抗免疫反应中有着重要作用[7]；本研究中的分离株通过在线糖基化位点分析软件对HA蛋白氨基酸序列分析显示，18株分离株中共发现潜在糖基化位点15个，其中稳定存在的糖基化位点有9个，分别为8NST、22NGT、38NAT、45NSS、63NCT、165NVT、246NST、285NGS、483NGT/NET，8个位于HA1区，1个位于HA2区。2015年分离株与疫苗株A/Switzerland/9715293/2013对比，有2株分离株发生N144S变异，导致144NSS潜在糖基化位点消失，并且出现A128T和K160T变异，分别新增潜在糖基化位点126NWT和158NYT。2017年分离株与疫苗株A/Hong Kong/4801/2014对比，有4株分离株发生T135N/K变异，分别导致糖基化位点135NSS替代133NGT或133NGT消失，其中分离株A/Zhejiangkecheng/1841/2017同时出现S124R变异，导致糖基化位点122NES消失（表 2）。
| 毒株名称 | 糖基化位点 | |||||
| 122NES | 126NWT | 133NGT | 135NSS | 144NSS | 158NYT | |
| A/Zhejiangkecheng/1591/2015 | + | - | + | |||
| A/Zhejiangkecheng/1692/2015 | + | - | + | |||
| A/Zhejiangkecheng/1680/2017 | - | + | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1771/2017 | - | + | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1841/2017 | - | - | ||||
| A/Zhejiangkecheng/1854/2017 | - | |||||
| 注：糖基化位点参照同年度疫苗株；“+/-”表示增加（+）和缺失（-）潜在糖基化位点 | ||||||
H3N2亚型流感病毒由H2N2流感病毒和禽流感病毒H3重配变异而来，并于1968年在香港首先引起暴发流行[8]；在过去的数十年内，H3N2亚型病毒经历着不断的变异进化，我国的流感疫情中，H3N2亚型流感病毒感染是主要型别之一[9-10]；衢州市2015-2017年流感监测结果显示，在流感病例中，H3N2亚型流感病毒感染率居首位，其病毒分离株占总毒株数的51.33%，为流感流行的优势毒株，尤其在2017年夏季出现明显的流行高峰，与我国大部分南方省份流行情况一致[11]，这提示我们需进一步加强H3N2亚型流感病毒的病原学监测，密切关注其变异进化情况。
H3N2亚型流感病毒HA基因分为多个基因型，目前全球流行的主要为3C系，而且3C系又可分为多个支系[12-13]。本研究通过对衢州市分离的18株H3N2亚型流感病毒HA基因分析发现，2015-2017年衢州市H3N2亚型流行株均为3C系，但支系从2015年的3C.3a逐渐转变为3C.2a支系，其中，2015年跨越2个支系，与同年度疫苗株A/Switzerland/9715293/2013的遗传距离逐渐加大，提示其疫苗免疫效果可能下降。同源性分析显示，2016年和2017年分离株与2016-2018年度疫苗株A/Hong Kong/4801/2014的核苷酸和氨基酸平均遗传距离呈现出扩大趋势，与系统进化树分析结果一致；说明WHO推荐的北半球疫苗株A/Hong Kong/4801/2014与当前流行株的匹配性可能降低，提示当前H3N2亚型流感病毒正逐渐变异进化。
甲型流感病毒的HA蛋白是其重要的表面抗原，也是变异频率最高的抗原之一，其HA1蛋白分子上最少含有5个抗原决定簇（A、B、C、D、E）；抗原决定簇上氨基酸位点的变异，可能导致病毒抗原性和致病特征的改变[14-15]。本研究通过对分离株HA氨基酸序列与同年度疫苗株比较分析发现，涉及抗原决定簇上的位点变异共有22个，覆盖5个区域，其中A区变异率最高，有7个位点发生了变异，位点中变异频率最高的有T131K、R142G/S/K和S144N/K，均位于A区；上述位点的变异能够满足流感病毒抗原漂移的要求[16]，提示病毒在抗原性上可能发生了较大变异，意味着其在一定范围内有可能出现更高强度的流行，这与我国部分南方省份的流感流行状况是一致的[11]。研究表明，流感病毒HA蛋白上受体结合位点的改变，能够影响病毒的增殖、免疫原性和宿主的特异性[17-18]；本研究发现部分分离株在受体结合位点上发生了T131K和T135N/K变异，可能对病毒的机体免疫和进化有一定的影响，具体作用还有待进一步的研究。
HA蛋白上糖基化位点的改变，可能会导致病毒结构和抗原性发生变化，从而影响宿主的免疫系统反应，帮助病毒实现有效的免疫逃逸[19-20]。本研究中部分分离株有多个糖基化位点发生变异，包括144NSS、133NGT、122NES潜在糖基化位点的消失，以及126NWT、135NSS、158NYT糖基化位点的增加；其中135NSS和144NSS糖基化位点位于抗原决定簇A区，133NGT和135NSS糖基化位点位于受体结合部位，这些变异可能导致机体对感染病毒的清除障碍，促进病毒发生抗原性漂移，以及引发病毒与宿主细胞受体结合的改变。
综上所述，通过对衢州市2015-2017年H3N2亚型流感病毒HA的基因特征、抗原表位、受体结合位点和糖基化位点的分析研究，显示出流感病毒H3N2正处于不断变异进化之中，尤其在抗原位点上已呈现出较大变异，这意味着目前疫苗株A/Hong Kong/4801/2014对病毒的免疫效果可能下降，其防控策略有待进一步调整。
作者贡献:
黄世腾 ORCID：0000-0002-2789-9306
黄世腾：实验研究、数据分析及论文撰写
杨瑞军、吕磊：参与实验研究和数据分析
陈旭富、叶承华、万圣：参与数据分析和文章修改
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