2018, Vol. 33扩展功能
文章信息
- 蔡静, 张鑫, 魏黛珏, 李凯, 同重湘
- Cai Jing, Zhang Xin, Wei Daijue, Li Kai, Tong Chongxiang
- 甘肃省53株非结核分枝杆菌对9种常用抗结核药物的敏感性分析
- Analysis on susceptibility of 53 non tuberculosis mycobacterium isolates to 9 common anti-tuberculosis drugs in Gansu
- 疾病监测, 2018, 33(6): 515-519
- Disease Surveillance, 2018, 33(6): 515-519
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.06.016
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文章历史
- 收稿日期：2017-12-07
随着现代细菌培养技术、分子生物学技术以及生物信息技术的发展，非结核分枝杆菌（non tuberculosis mycobacteria，NTM）发现率不断提高，引起临床对NTM肺病的重视。目前已知的NTM有160余种（http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html），其中部分为条件致病菌。与结核分枝杆菌相比，条件致病NTM毒力及致病性较低，常引起人体继发性感染，患者大部分有免疫损害（尤其是AIDS患者）或慢性疾病（矽肺、肺结核残余空洞、慢性阻塞性肺病等）[1-4]。NTM肺病与肺结核病临床症状相同或近似，影像结果易混淆，细菌抗酸染色均为阳性，而治疗手段却不相同[5-8]。NTM肺病使用普通抗结核方案治疗具有很高的耐药率，以致治疗效果不佳，故须用细菌培养和菌种鉴定方法确定为NTM后再进行药敏试验[9]，以指导临床有效用药。本研究以2012－2014年甘肃省传染病院鉴定分离的NTM为研究对象，运用5种生化实验和16S rRNA序列测定鉴定到种，并用基于罗氏培养基的绝对浓度法对9种常用抗结核药进行药物敏感性实验，为甘肃省NTM肺病的治疗提供基础科学依据。
1 材料与方法 1.1 菌株来源收集甘肃省传染病院2012－2014年的阳性分枝杆菌1 081株。
1.2 培养基与试剂菌株纯化采用改良罗氏空白培养基、药敏培养采用改良罗氏含药培养基，菌株基因组提取试剂盒和PCR扩增试剂来自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.3 菌种鉴定将收集到的1 081株分枝杆菌阳性菌株，首先用硝基苯甲酸（PNB）及噻吩-2-羧酸肼（TCH）选择性培养基鉴别出NTM，然后利用4种生化实验耐热触酶试验、28 ℃生长试验、吐温-80水解试验和硝酸盐还原试验初步鉴定NTM；利用16S rRNA引物将NTM的DNA进行PCR扩增，正向引物序列（F）：GAC TCG GTA CTA GTT TGA GA，反向引物序列（R）：ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT，扩增产物大小为1 550 bp。PCR扩增体系为50 μl：10 μmol/L引物各2 μl，2×Taq Master Mix 25 μl，DNA模板2 μl，双蒸水（ddH2O）19 μl；阴性对照体系中不加DNA模板，ddH2O 21 μl，其他不变。扩增产物由北京天一辉远生物科技有限公司测序，并将基因序列提交美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源性比对。
1.4 药物敏感性试验经常规罗氏培养基上培养增菌后，采用改良罗氏培养基绝对浓度法进行药物敏感性试验，具体按《结核病诊断细菌学检验规程》进行[10-11]。共检测9种抗结核药物：链霉素（SM）、异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、丙硫异烟胺（TH1321）、对氨基水杨酸钠（PAS）、左氧氟沙星（LVFX）、卡那霉素（KAN）、吡嗪酰胺（PZA），对非结核分枝杆菌的耐药性。
2 结果 2.1 NTM的鉴别及分离率NTM的PNB/TCH生长试验及生化试验结果见表 1，经过鉴别初筛从1 081株阳性分枝杆菌中鉴定出NTM 53株，分离率为4.90%。53株NTM经16S rRNA基因片段测序分析，结果为胞内分枝杆菌（M. intracellulare）36株（67.92%），堪萨斯分枝杆菌（M. kansasii）8株（15.09%），鸟分枝杆菌（M. avium）4株（7.55%），戈登分枝杆菌（M. gordonae）2株（3.77%），脓肿分枝杆菌（M. abscessus）2株（3.77%），偶然分枝杆菌（M. fortuitum）1株（1.89%）。
| 菌株(株） | PNB培养基 | TCH培养基 | 28℃生长试验 | 耐热触酶试验 | 硝酸盐还原试验 | 吐温-80水解试验 |
| 胞内分枝杆菌(36) | + | + | + | + | - | - |
| 堪萨斯分枝杆菌(8) | + | + | + | + | + | + |
| 鸟分枝杆菌(4) | + | + | + | V(1) | - | - |
| 戈登分枝杆菌(2) | + | + | + | + | - | + |
| 脓肿分枝杆菌(2) | + | + | + | V(1) | - | V(1) |
| 偶然分枝杆菌（1) | + | + | + | + | + | + |
| 注:阳性; -阴性; V部分阳性，括号内数据为阳性数 | ||||||
53株NTM经过16S rRNA序列相似性比对，结果发现胞内分枝杆菌最多36株，占67.93%，序列同源相似性98.2%~ 99.4%；其次为堪萨斯分枝杆菌8株，占15.09%，序列同源相似性98.4%~99.7%；再次为鸟分枝杆菌4株，占7.55%，序列同源相似性98.3%~99.8%，见表 2。
| 菌株 | 菌株编号 | 菌株数 | 同源序列 | 同源相似性(%) | 比例(%) |
| 胞内分枝杆菌 | S1 | 36 | Streptomvces ihivogriseus(KF991636) | 98.2~99.4 | 67.93 |
| 堪萨斯分枝杆菌 | S2 | 8 | Streptomvces xdntholiticus (EU570689) | 98.4~99.7 | 15.09 |
| 鸟分枝杆菌 | S3 | 4 | Mvcolrncterium avium (LT558822) | 98.3 ~99.8 | 7.55 |
| 戈登分枝杆菌 | S5 | 2 | Streptomvces bicilhiris(KC493993) | 99.1 ~99.3 | 3.77 |
| 脓肿分枝杆菌 | S6 | 2 | Streptomvces europneisciibiei (HQ441821) | 99.6 | 3.77 |
| 偶然分枝杆菌 | S8 | 1 | Streptomyces roseus(EF017710) | 98.9 | 1.89 |
部分NTM菌株的总DNA提取（A）和16S rDNA基因片段的PCR扩增电泳检测（B）见图 1。
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| 图 1 部分非结核分枝杆菌的总DNA提取（A）和16S rRNA基因片段的PCR扩增电泳检测（B） Figure 1 Results of total DNA extraction of partial NTM strains(A)and PCR amplification electrophoretogram of 16S rDNA gene(B) |
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53株NTM对9种抗结核药物的药敏结果显示，RFP耐药率最高，为73.58%（39/53）；其次是TH1321耐药率，为69.81%（37/ 53），其余依次为INH（67.92%）、SM（62.26%）、PAS（60.38%）、PZA（47.17%）、EMB（28.30%）、LVFX（26.41%）、KAN（15.09%），见表 3。NTM对抗结核药物表现出多重耐药，同时耐6种药的耐药率高达22.64%（12/53）。53株NTM对9种抗结核药总耐药率高达92.45%（49/53）。
| 药物 | 低浓度 | 高浓度 | 总耐药率（%） | |||
| 耐药菌株数 | 耐药率(%) | 耐药菌株数 | 耐药率(%) | |||
| 利福平 | 29 | 54.72 | 10 | 18.87 | 73.58 | |
| 异烟肼 | 25 | 47.17 | 11 | 20.75 | 67.92 | |
| 链霉素 | 24 | 45.28 | 9 | 16.98 | 62.26 | |
| 乙胺丁醇 | 13 | 24.53 | 2 | 3.77 | 28.30 | |
| 丙硫异烟胺 | 35 | 66.04 | 2 | 3.77 | 69.81 | |
| 对氨基水杨酸钠 | 20 | 37.74 | 12 | 22.64 | 60.38 | |
| 吡嗉酰胺 | 20 | 37.74 | 5 | 9.43 | 47.17 | |
| 左氧氟沙星 | 12 | 22.64 | 2 | 3.77 | 26.41 | |
| 卡那霉素 | 3 | 5.66 | 5 | 9.43 | 15.09 | |
6种不同NTM菌株对9种抗结核药物的耐药率见表 4。6种NTM菌株均对一线抗结核药物表现为高耐药，其中RFP的耐药率最高；胞内分枝杆菌对9种抗结核药物的耐药率均＞50%。
| 药物 | 胞内分枝杆菌 | 堪萨斯分枝杆菌 | 鸟分枝杆菌 | 戈登分枝杆菌 | 脓肿分枝杆菌 | 偶然分枝杆菌 | |||||||||||
| 菌株 | 耐药率(%) | 菌株 | 耐药率(%) | 菌株 | 耐药率(%) | 菌株 | 耐药率(%) | 菌株 | 耐药率(%) | 菌株 | 耐药率(%) | ||||||
| 利福平 | 34 | 94.44 | 7 | 87.50 | 4 | 100.00 | 2 | 100.00 | 2 | 100.00 | 1 | 100.00 | |||||
| 丙硫异烟胺 | 29 | 80.56 | 5 | 62.50 | 2 | 50.00 | 1 | 50.00 | 2 | 100.00 | 1 | 100.00 | |||||
| 异烟肼 | 33 | 91.67 | 6 | 75.00 | 1 | 25.00 | 1 | 50.00 | 2 | 100.00 | 1 | 100.00 | |||||
| 链霉素 | 35 | 97.22 | 5 | 62.00 | 3 | 75.00 | 1 | 50.00 | 2 | 100.00 | 1 | 100.00 | |||||
| 对氨基水杨酸钠 | 28 | 77.70 | 2 | 25.00 | 0 | 0.00 | 1 | 50.00 | 0 | 0.00 | 0 | 0.00 | |||||
| 吡嗉酰胺 | 36 | 100.00 | 4 | 50.00 | 3 | 75.00 | 2 | 100.00 | 2 | 100.00 | 1 | 100.00 | |||||
| 乙胺丁醇 | 26 | 72.22 | 5 | 62.50 | 2 | 50.00 | 1 | 50.00 | 1 | 50.00 | 0 | 0.00 | |||||
| 左氧氟沙星 | 24 | 66.67 | 6 | 75.00 | 3 | 75.00 | 2 | 100.00 | 1 | 50.00 | 1 | 100.00 | |||||
| 卡那霉素 | 21 | 58.33 | 1 | 12.50 | 1 | 25.00 | 1 | 100.00 | 0 | 0.00 | 0 | 0.00 | |||||
目前已报道的NTM有160多种，有的种又包含了多个亚种，不同菌（亚）种间对抗生素的耐药程度具有较大差异。绝大部分NTM对常用抗结核药物具有天然耐药性[11-13]，用抗结核药物治疗疗效欠佳。文献报道NTM广泛耐药是NTM细胞壁屏障及细胞表面高疏水性所致[12-14]。
本研究结果表明，53株NTM菌株对9种抗结核药物总耐药率高达92.45%（49/53），与方木通等[15]报道相似，与2000年全国流行病学调查报道的NTM总耐药率（95.90%）相近[16]。NTM对RFP耐药率最高，为73.58%（39/53），对TH1321、INH、SM、PAS的耐药率相近，对LVFX耐药率较低，为26.41%（14/ 53），对KAN的耐药率最低，为15.09%（8/53）。齐志强等[6]从湖南地区分离出的225株NTM菌株对SM、INH、EMB、RFP、PAS、氧氟沙星表现出很高的耐药性，与本研究结果一致。吴龙章等[17]报道广州市分离的1 819株NTM菌株对本研究涉及的药物均表现出高度耐药性（耐药率均＞70%），其中LVFX的耐药率明显高于本研究（72.90% vs. 26.41%）。
甘肃省传染病院于2012－2014年分离的1 081株分枝杆菌中，胞内分枝杆菌的比例比其他的NTM菌株高，初步说明胞内分枝杆菌是该院NTM肺病的主要致病菌株。此外，甘肃省传染病院是本省最大的传染病医院，一些分枝杆菌肺病患者在基层医院由于无法做菌种鉴定且耐药较严重，久治不愈或复发率高转而到该院就医，致使该院胞内分枝杆菌分离率较高。笔者进行药敏试验后发现胞内分枝杆菌对9种一、二线抗结核药的耐药率均达到58%以上。Jing等[18]报道52株胞内分枝杆菌对INH、RFP、EMB和SM的耐药率均在50%以上。提示对甘肃省分离的NTM菌株应鉴定到种并进行药物敏感性实验，以指导临床用药。本研究其他种的NTM菌株数量较少，应加大菌株数量测定药敏结果方可为临床用药提供可靠的科学依据。
本研究采用的是绝对浓度法检测NTM菌株对不同药物的耐药性，结果发现NTM对不同药物低浓度和高浓度的耐药性有差异，与柴华和包训迪[19]报道相似。NTM在某些药物低浓度时耐药，但在高浓度时敏感，建议临床医生在保证用药安全的前提下加大该药物的剂量，或者考虑使用新药物进行治疗。
随着学者对NTM菌种鉴定及耐药性的深入研究，对NTM引起疾病的治疗也将得到改善。
作者贡献:
蔡静 ORCID：0000-0002-3297-0285
蔡静：实验设计及操作
张鑫：论文初稿及实验
魏黛珏、李凯：参与具体实验工作
同重湘：课题设计及论文修改
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