引发手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)的肠道病毒有20多种(型)，其中以肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71) 和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie A16，Cox A16)最为常见，而且发病死亡的患儿中主要是因为感染了EV71^[1]。目前世界上几起严重的手足口病暴发流行均由EV71感染引起^[2]，EV71日益引起人们的警惕和关注。 本研究对山东省济南地区2010-2013年手口病患儿感染EV71的流行病学特征进行了分析，现报告如下。

选取2010-2013年济南地区临床诊断为手足口病病例为研究对象，共计3351例，采集患者发病1周内的粪便标本，4 ℃冷链运输，-80 ℃保存备用。手足口病重症病例诊断符合卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2009年版)。

病毒RNA提取试剂(Roche公司)，One-Step RT-PCR试剂盒(QIAGEN公司)，PCR引物由北京华大基因研究中心合成；PCR扩增仪(Eppendorf公司)，QIAxcel全自动毛细管核酸分析仪(QIAGEN公司)。

取大约2.0 g粪便标本加入标记好的离心管中，每管中加入9 ml PBS、1 ml氯仿；用冷冻离心机在8000 r/min条件下离心20 min，收集上清液4～8 ℃备用。

采用Roche公司的 High Pure Viral RNA Kit，严格按照试剂盒说明书进行操作，提取的RNA立即进行实验，剩余提取物于-80 ℃保存。

采用EV 5′端非编码区通用引物和EV71、Cox A16 VP1区特异性引物进行RT-PCR检测，引物序列和反应条件参考《手足口病防控指南》(2009年版)；EV71扩增产物大小为226 bp，Cox A16扩增产物大小为208 bp，肠道病毒通用引物(EV)扩增产物大小为116 bp。PCR产物经QIAxcel全自动毛细管核酸分析系统对相应条带进行分析。

采用SPSS 11.0统计软件对病例流行病学资料进行χ²检验，P < 0.01为差异有统计学意义。

采用PE、EV71和Cox A16特异性引物对手足口病患者标本进行RT-PCR检测，结果显示，在3351例手足口病患者(包括114例重症患者)标本中，2548例检测到肠道病毒，阳性率为76.04%。其中EV71阳性1001例，占阳性病例总数的39.29%；Cox A16阳性930例，占阳性病例总数的36.50%；其他肠道病毒阳性609例，占阳性病例总数的23.90%；EV71和Cox A16混合感染阳性8例，占阳性病例总数的0.31%；EV71在不同年度的流行强度不同，见表1。114例重症病例中，109例检测到肠道病毒(95.61%)，其中感染EV71的有92例，阳性率为80.70%；3237例普通病例中感染EV71的有909例，阳性率为28.08%；重症和普通病例中EV71阳性率差异有统计学意义(χ²=131.9135，P < 0.01)。

2010-2013年济南地区手足口病发病具有明显的季节性，3月中旬出现上升趋势，4 5月达到高峰(31.70%)，7月开始明显下降。

EV71流行与手足口病的总体发病情况不同，且在不同年度的流行趋势不同。2010年EV71流行较弱，但EV71病例数随时间变化逐渐升高，11 12月达到顶峰(48.95%)；2011年EV71流行增强，成为优势病原体，但感染病例数随时间变化呈降低趋势，12月达到低谷(0.60%)；2012年首次出现EV71和Cox A16混合感染病例，EV71流行减弱，但感染病例数随时间变化逐渐升高，于10月达到高峰(17.37%)随后降低；2013年EV71重新成为优势病原体，感染病例数随时间变化先降低后升高，5月达到顶峰(18.82%)，继而降低并趋于稳定，见图1。

图 1 2010-2013年济南地区EV71病例数月分布 Fig.1 Monthly distribution of EV71 caused HFMD cases in Jinan，2010-2013

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EV71阳性率在不同年度的变化趋势亦不同，在作为优势病原体流行的年度，其阳性率随时间变化呈下降趋势，否则呈上升趋势，见图2。

图 2 2010-2013年济南地区EV71阳性率月变化趋势 Fig.2 Monthly positive rates of EV71 in Jinan，2010-2013

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2010-2013年济南地区EV71感染手足口病患儿共1001例，其中男性616例，女性385例，男女性别比为1.60∶1；4年间EV71感染的手足口病病例分别为190、334、190和287例，男女性别比分别为1.68、1.69、1.71和1.39，见表2。

EV71感染手足口病患者各年龄组分布及构成比见表3。在1001例确诊EV71感染的患儿中，年龄最小的4月龄，最大的15岁；病例年龄主要集中在4岁以下儿童(84.42%)，尤其是1～3岁年龄组(48.65%)，5岁以上年龄组只占全部感染病例的7.19%，提示4岁以下儿童为EV71易感人群。

2010-2013年济南地区发生的114例重症手足口病病例中，109例感染了肠道病毒，阳性率为95.61%。其中感染EV71的有92例(包括2例死亡病例)，占阳性病例的84.40%；感染Cox A16的8例，占阳性病例的7.34%；感染其他肠道病毒的9例，占阳性病例的8.26%。经统计学分析，EV71阳性率显著高于其他病毒类型 (χ²=245.24，P < 0.01)，是济南地区重症手足口病流行的主要致病病毒。

92例EV71感染所致重症手足口病患儿中，男性68例，女性24例，男女性别比为2.83 ∶ 1，男性病例明显高于女性(χ²=106.6154，P < 0.01)，2例死亡病例均为男性；其中年龄最大的4岁，最小的4个月，发病年龄主要集中于3岁以下幼童，占发病总数的89.13%(82/92)，2例死亡病例均不到1岁。

EV71是一种具有较强感染性和致病性的肠道病毒，人类是EV71感染的唯一自然宿主，由于其易感人群主要是5岁以下的婴幼儿，且传播途径复杂、传播速度快，可引起中枢神经系统近远期并发症甚至死亡而引起社会各界的高度关注^[3]，已成为严重威胁儿童健康的公共卫生问题。

本研究发现，EV71在济南地区全年流行，不同年度流行趋势不同。EV71作为优势病原体流行结束后，由于部分易感儿童自然感染后产生了保护性抗体^{[4, 5]}，下一年度其流行强度就会减弱，而上海市2010-2011年手足口病均以EV71流行为主^[6]；在作为优势病原体的年度，EV71阳性率随时间变化呈下降趋势，而在流行较弱年度正好相反。

根据人群分布特征，济南地区EV71感染手足口病患儿中男童比例高于女童(1.60∶1)，与东南亚地区的研究一致^[4]，提示男童更易感；患儿年龄主要集中于4岁以下(84.42%)，尤其是1~3岁年龄组(48.65%)。92例EV71感染重症手足口病患儿中男童所占比例更高(2.83∶1)，其中2例死亡病例均为男性，男性患儿成为手足口病重症及死亡病例的主要特征人群；重症患儿年龄更小，3岁以下幼童占89.13%，其中2例死亡病例年龄均不到1岁，与以往研究一致^[7]，可能因为年龄越小，病情越重，预后亦相对较差。

本研究还发现，济南地区109例感染肠道病毒的重症病例中，EV71感染92例，占阳性病例的84.40%，说明济南地区重症手足口病感染病原主要为EV71，与中国台湾的报道不同^[8]，而与中国大陆的报道相似^{[7, 8, 9]}；其中2例死亡病例均是由EV71感染引起，经测序证实为C4亚型^[10]。因此，及时阐明手足口病患者的病原构成，在EV71占绝对优势的局部地区尽早对重点人群采取相关的干预措施是预防重症手足口病的关键。

EV71流行对我国儿童健康造成严重危害，尤其可导致神经系统损害，给社会、医疗机构和家庭带来了严重的负担。因此，应密切观察EV71感染手足口病的流行特征，分析流行规律，以制订更有效的防控措施。