利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测鸭沙门菌

韩营营 段瑶 刁保卫 闫梅英

引用本文: 韩营营, 段瑶, 刁保卫, 闫梅英. 利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测鸭沙门菌[J]. 疾病监测. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.04.007 shu
Citation:  Yingying Han, Yao Duan, Baowei Diao and Meiying Yan. Application of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction for rapid identification and detection of Salmonella Anatum[J]. Disease Surveillance. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.04.007 shu

利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测鸭沙门菌

    作者简介: 韩营营,女,河北省沧州市人,硕士,主要从事病原微生物检验工作,Email:13718910302@163.com;
    通信作者: 闫梅英, yanmeiying@icdc.cn
  • 基金项目: 国家重点研发计划(No. 2017YFC1601202)

摘要: 目的为快速检测、鉴定鸭沙门菌,避免血清型误判,提高鸭沙门菌暴发应对能力,建立一种实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法。方法随机挑选60株鸭沙门菌及238株肠道常见病原菌代表菌株,针对鸭沙门菌血清型特异基因AW58_15605设计引物并建立qPCR检测体系,通过纯菌菌株、模拟粪便样本及临床样本评价该体系的特异度、灵敏度及检测下限。结果60株鸭沙门菌株及临床感染的50份样本扩增结果均为阳性,而对鸭沙门菌血清型以外的其他沙门菌及肠道菌的扩增均为阴性。 对鸭沙门菌纯菌DNA的最低检测下限为8拷贝/反应。 粪便模拟样本检测中,增菌后qPCR检测下限达59.10 cfu/g,明显低于分离培养及增菌前。结论本研究建立的基于特异基因的鸭沙门菌分子检测方法具有可操作性强、特异度高、灵敏度高的特点,建议在应急情况下优先选择qPCR用于沙门菌暴发筛查、鉴别及诊断由其引起的腹泻性疾病。

English

    1. [1]

      World Health Organization, WHO estimates of the global burden of foodborne diseases[Z]. 2015.03.12. ISBN: 9789241565165.

    2. [2]

      Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens[J]. Emerg Infect Dis, 2011,17(1):7–15. DOI:10.3201/eid1701.P11101.

    3. [3]

      Hao RZ, Li P, Wang Y, et al. Diversity of pathogens responsible for acute diarrheal disease in China[J]. Clin Infect Dis, 2013,57(12):1788–1790. DOI:10.1093/cid/cit572.

    4. [4]

      顾宝柯, 袁政安, 金汇明, 等. 上海市沙门菌病流行特征分析[J]. 环境与职业医学,2008,25(3):245–247, 251. DOI:10.13213/j.cnki.jeom.2008.03.014.
      Gu BK, Yuan ZA, Jin HM, et al. Epidemiological surveillance of salmonellosis in Shanghai[J]. J Environ Occup Med, 2008,25(3):245–247, 251. DOI:10.13213/j.cnki.jeom.2008.03.014.

    5. [5]

      World Health Organization, WHO Salmonella (non-typhoidal). Fact sheet[Z]. 2018.02.20.

    6. [6]

      朱奇, 陆斌兴, 覃有泉, 等. 沙门氏菌生物学研究进展[J]. 疾病监测与控制,2015,9(7):474–478.
      Zhu Q, Lu BX, Qin YQ, et al. Research progress on biological Salmonella Enteric[J]. J Dis Monit Control, 2015,9(7):474–478.

    7. [7]

      韩营营, 段瑶, 李杰, 等. 利用PCR快速检测粪便标本中的鸭沙门菌[J]. 疾病监测,2018,33(3):246–250. DOI:10.3784/j.issn.1003–9961.2018.03.018.
      Han YY, Duan Y, Li J, et al. Rapid detection of Salmonella Anatum in stool samples using PCR[J]. Dis Surveill, 2018,33(3):246–250. DOI:10.3784/j.issn.1003–9961.2018.03.018.

    8. [8]

      李杰, 肖燕, 樊粉霞, 等. 利用双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应技术鉴别诊断粪便标本中的伤寒和甲型副伤寒沙门菌[J]. 疾病监测,2014,29(4):310–315. DOI:10.3784/j.issn.1003–9961.2014.04.015.
      Li J, Xiao Y, Fan FX, et al. Establishment of dual TaqMan fluorescent quantitative polymerase chain reaction to detect and differentiate Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi A in stool samples[J]. Dis Surveill, 2014,29(4):310–315. DOI:10.3784/j.issn.1003–9961.2014.04.015.

    9. [9]

      Majchrzak M, Krzyzanowska A, Kubiak AB, et al. TRS-based PCR as a potential tool for inter-serovar discrimination of Salmonella Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Virchow, S. Hadar, S. Newport and S. Anatum[J]. Mol Biol Rep, 2014,41(11):7121–7132. DOI:10.1007/s11033–014–3592–9.

    10. [10]

      Guo D, Liu B, Liu FX, et al. Development of a DNA microarray for molecular identification of all 46 Salmonella O serogroups[J]. Appl Environ Microbiol, 2013,79(11):3392–3399. DOI:10.1128/AEM.00225–13.

    11. [11]

      McQuiston JR, Waters RJ, Dinsmore BA, et al. Molecular determination of H antigens of Salmonella by use of a microsphere-based liquid array[J]. J Clin Microbiol, 2011,49(2):565–573. DOI:10.1128/JCM.01323–10.

    12. [12]

      Fan FX, Yan MY, Du PC, et al. Rapid and sensitive Salmonella Typhi detection in blood and fecal samples using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification[J]. Foodborne Pathog Dis, 2015,12(9):778–786. DOI:10.1089/fpd.2015.1950.

    1. [1]

      韩营营段瑶李杰闫梅英 . 利用PCR快速检测粪便标本中的鸭沙门菌. 疾病监测, 2018, 33(3): 246-250. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.03.018

    2. [2]

      崔志刚王爱敏王鸣柳许学斌崔晶花杜小莉闫梅英卢珊 . 婴幼儿腹泻感染的非伤寒沙门菌分子分型和耐药情况研究. 疾病监测, 2014, 29(6): 428-431. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.201.06.004

    3. [3]

      段瑶李杰阚飙闫梅英 . 2006-2016年我国畜禽动物源性沙门菌血清型分布及其耐药特征. 疾病监测, 2019, 34(4): 296-302. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.04.005

    4. [4]

      . 2009-2013年浙江省平湖市沙门菌临床感染血清型及耐药性分析. 疾病监测, 2014, 29(7): 560-563. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2014.07.014

    5. [5]

      李东迅王艳马爱静王毅刘凯刘东鑫王和叶长芸 . 单增李斯特菌1/2c血清型菌株生物膜相关基因分析及耐药性研究. 疾病监测, 2016, 31(5): 387-393. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.05.009

    6. [6]

      范如岳白向宁傅珊珊许艳梅熊衍文 . 非O157产志贺毒素大肠埃希菌分离株血清型鉴定及主要毒力基因分析. 疾病监测, 2017, 32(9): 716-720. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.09.004

    7. [7]

      . 贝类水产中副溶血性弧菌菌型分布研究. 疾病监测, 2014, 29(7): 522-527. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2014.07.005

    8. [8]

      李东迅王艳马爱静王毅刘凯刘东鑫王和叶长芸 . 单增李斯特菌1/2c血清型菌株生物膜形成能力的研究. 疾病监测, 2015, 30(6): 474-478. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2015.06.011

    9. [9]

      陈建辉欧剑鸣陈伟伟杨劲松徐海滨罗朝晨陈爱平许学斌 . 1984-2016年福建省人源与食源性沙门菌血清分型和耐药特征研究. 疾病监测, 2019, 34(4): 316-321. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.04.009

    10. [10]

      刘永华冯云尹小雄杨召兰李萍张智萍尹正留张海林 . 2014年云南省瑞丽市登革1和2型病毒流行的分子流行病学研究. 疾病监测, 2016, 31(1): 8-13. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.01.004

    11. [11]

      张爽李颖张彦春马红梅王园园张赫 . 2015-2017年北京市顺义区腹泻病例副溶血弧菌流行特征与分子分型特征分析. 疾病监测, 2018, 33(5): 381-386. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.05.008

    12. [12]

      王红赵鹏杜悦何德辉苏爱荣蓝兰李秀桂黄彦 . 多菌型副溶血性弧菌共感染引起集中事件调查分析. 疾病监测, 2018, 33(4): 312-315. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.04.012

    13. [13]

      张兰荣王艳张扬高翔甄博珺张冲邹林刘晓峰金东李伟王天姝余波贺春月叶长芸 . 2011年北京市通州区分离单增李斯特菌的生物学及分子流行病学特征. 疾病监测, 2012, 27(7): 562-564. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2012.7.018

    14. [14]

      岳峰方正孙永崔志刚 . 2013-2015年安徽省合肥市食源性疾病患者分离沙门菌的病原学特征分析. 疾病监测, 2019, 34(4): 312-315. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.04.008

    15. [15]

      商晓春周晓红帅慧群赵雪琴张睿 . 一起多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒脉冲场凝胶电泳分析. 疾病监测, 2013, 28(7): 598-602. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.7.023

    16. [16]

      陈素菜沈丽珍 . 浙江省温州地区肝脓肿患者中肺炎克雷伯菌特征分析. 疾病监测, 2019, 34(2): 158-161. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.02.015

    17. [17]

      牛桓彩吴杨舒高林刘毅马文军李东迅 . 北京市昌平区食源性单增李斯特菌特征分析. 疾病监测, 2018, 33(6): 463-468. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.06.006

    18. [18]

      李华王艳王毅叶长芸 . 农贸市场中蜚蠊携带单增李斯特菌的调查及菌株特征分析. 疾病监测, 2017, 32(4): 318-322. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.04.015

    19. [19]

      袁士杰张建群黄邵军 . 2014-2018年浙江省余姚市非伤寒沙门菌监测及其耐药谱分析. 疾病监测, 2019, 34(8): 725-730. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.08.011

  • 图 1  实时荧光定量聚合酶链式反应扩增曲线及标准曲线方程

    Figure 1.  Amplification curve and fitting curve equation of qPCR

    表 1  鸭沙门菌荧光定量聚合酶链式反应特异性及灵敏性检测

    Table 1.  Specificity and sensitivity of qPCR assay for detection of S. Anatum

        菌 种菌株数(株)菌 种菌株数(株)
    S. Aberdeen(阿伯丁沙门菌) 1S. Newport(纽波特沙门菌) 1
    S. Abony(阿邦尼沙门菌) 3S. Othmarschen(奥兹马森沙门菌) 2
    S. Agona(阿贡纳沙门菌) 5S. Oranienburg(奥雷宁堡沙门菌) 1
    S. Anatum(鸭沙门菌)60S. Panama(巴拿马沙门菌) 1
    S. Bareilly(巴雷利沙门菌) 2S. ParatyphiA(甲型副伤寒沙门菌)10
    S. Berta(贝塔沙门菌) 1S. Paratyphi B(乙型副伤寒沙门菌) 2
    S. Bledam(布利丹沙门菌) 1S. ParatyphiC(丙型副伤寒沙门菌) 2
    S. Bonariensis(波那雷思沙门菌) 1S. Pakistan(巴基斯坦沙门菌) 1
    S. Bovismorbificans(病牛沙门菌) 3S. Rechovot(雷希伏特沙门菌) 1
    S. Braenderup(布伦登卢普沙门菌) 5S. Rissen(里森沙门菌) 4
    S. Bredeney(布雷登尼沙门菌) 1S. Rubislaw(鲁比斯劳沙门菌) 1
    S. Cerro(塞罗沙门菌) 2S. Ruzizi(鲁奇奇沙门菌) 2
    S. Chincol(钦科沙门菌) 1S. Saintpaµl(圣保罗沙门菌) 5
    S. Choleraesuis(猪霍乱沙门菌) 1S. Schwarzengrund(胥伐成格隆沙门菌) 4
    S. Coeln(科隆沙门菌) 1S. Senftenberg(山夫登堡沙门菌) 1
    S. Colindale(科林德尔沙门菌) 1S. Stanley(斯坦利沙门菌) 1
    S. Derby(德尔卑沙门菌) 9S. Tennessee(田纳西沙门菌) 1
    S. Dublin(都柏林沙门菌) 1S. Thompson(汤卜逊沙门菌) 1
    S. Duesseldorf(杜塞道夫沙门菌) 1S. Typhi(伤寒沙门菌) 2
    S. Edmonton(爱德蒙顿沙门菌) 1S. Typhimurium(鼠伤寒沙门菌) 9
    S. Eko(埃科沙门菌) 1S. Uganda(乌干达沙门菌)3
    S. Enteritidis(肠炎沙门菌)12S. Virchow(维尔肖沙门菌) 4
    S. Fulica(福利卡沙门菌) 2S. Wandsworth(旺兹沃思沙门菌) 1
    S. Give(吉韦沙门菌) 9S. Weltevreden(韦太夫雷登沙门菌) 1
    S. Hardar(哈达尔沙门菌) 5S. Worthington(渥兴顿沙门菌) 3
    S. Havana(哈瓦那沙门菌) 1S. dysenteriae(痢疾志贺菌) 1
    S. Hillingdon(希林登沙门菌) 1S. flexneri(福氏志贺菌) 1
    S. Hvittingfoss(非丁伏斯沙门菌) 1S. boydii(鲍氏志贺菌) 1
    S. Heidelberg(海德堡沙门菌) 1S. sonnei(宋内志贺菌) 1
    S. Infantis(婴儿沙门菌) 4enteroaggregative Escherichia coli(肠粘附性大肠埃希菌) 1
    S. Israel(以色列沙门菌) 1enterotoxigenic E. coli(肠产毒性大肠埃希菌)26
    S. Javiana(爪哇纳沙门菌) 3enteroinvasive E. coli(肠侵袭性大肠埃希菌)11
    S. Kedouguo(凯杜古沙门菌) 1extraintestinal pathogenic E. coli(肠致病性大肠埃希菌) 2
    S. Kentucky(肯塔基沙门菌) 1enterohemorrhage E. coli(肠出血性大肠埃希菌) 2
    S. Koeningstuhl(科尼斯图沙门菌) 2Vibrio vulnificus(创伤弧菌) 1
    S. Liverpool(利物浦沙门菌) 1V. cholera O1 and O139(O1和O139群霍乱弧菌) 3
    S. London(伦敦沙门菌) 1V. parahemolyticus(副溶血弧菌) 4
    S. Mbandaka(姆班达卡沙门菌) 5Campylobacter spp.(弯曲杆菌) 4
    S. Meleagridis(火鸡沙门菌) 7Plesiomonas spp.(邻单胞菌) 2
    S. Montevideo(蒙得维的亚沙门菌) 4Y. enterocolitica(小肠结肠炎耶尔森菌) 2
    S. Muenchen(慕尼黑沙门菌) 1Bacillus cereus(蜡样芽孢菌)15
    S. Muenster(明斯特沙门菌) 4Klebsiella pneumonia(肺炎克雷伯菌) 4
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    表 2  粪便增菌前后荧光定量聚合酶链式反应最低检测下限

    Table 2.  Detection limit of qPCR before and after enrichment

     检测方法增菌前 Luria-Bertani增菌亚硒酸盐–半胱氨酸增菌
    4 h6 h16 h4 h6 h16 h
    粗制DNA-qPCR3.54×1055.91×1045.91×1025.91×102ND2.96×1035.91×102
    纯化DNA-qPCR3.54×1052.96×1035.91×1025.91×1025.91×1042.96×10359.10×100
    分离培养3.54×1072.96×1032.96×1032.96×1032.96×1032.96×1032.96×103
      注:最低检测下限为粪便中最低菌含量(cfu/g);ND代表未检测到目的基因
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    表 3  临床标本检测结果

    Table 3.  Results of clinical sample detection

      菌 株数量(份)
    鸭沙门菌(S. Anatum)50
    鼠伤寒沙门菌(S. Typhimurium)10
    肠炎沙门菌(S. Enteritidis)10
    弯曲杆菌(Campylobacter spp.) 3
    副溶血弧菌(V. parahemolyticus 5
    非O1非O139霍乱弧菌
    Vibrio cholera non-O1/O139)
    3
    肠致病性大肠埃希菌
    (extraintestinal pathogenic E. coli, EPEC)
    10
    肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic E. coli, ETEC) 3
    产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca 3
    小肠结肠炎耶尔森菌(Y. enterocolitica 3
    嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia20
    肠黏附性大肠埃希菌
    (enteroaggregative E.coli, EAEC)
    15
    其他 5
      注:其他为上述菌种检测结果为阴性
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  • 通信作者:  闫梅英, yanmeiying@icdc.cn
  • 收稿日期:  2019-01-02
  • 网络出版日期:  2019-04-23
  • 刊出日期:  2019-04-01
通信作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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