鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价

李博 崔燕 安静 古丽阿依·包开西 罗勇军 王信惠 黎唯 王效俊

李博, 崔燕, 安静, 古丽阿依·包开西, 罗勇军, 王信惠, 黎唯, 王效俊. 鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价[J]. 疾病监测, 2022, 37(5): 657-660. doi: 10.3784/jbjc.202103230145
引用本文: 李博, 崔燕, 安静, 古丽阿依·包开西, 罗勇军, 王信惠, 黎唯, 王效俊. 鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价[J]. 疾病监测, 2022, 37(5): 657-660. doi: 10.3784/jbjc.202103230145
Li Bo, Cui Yan, An Jing, Guliayi·Baokaixi, Luo Yongjun, Wang Xinhui, Li Wei, Wang Xiaojun. Establishment and evaluation of internal control of multiplex quantitative PCR for detection of Yersinia pestis[J]. Disease Surveillance, 2022, 37(5): 657-660. doi: 10.3784/jbjc.202103230145
Citation: Li Bo, Cui Yan, An Jing, Guliayi·Baokaixi, Luo Yongjun, Wang Xinhui, Li Wei, Wang Xiaojun. Establishment and evaluation of internal control of multiplex quantitative PCR for detection of Yersinia pestis[J]. Disease Surveillance, 2022, 37(5): 657-660. doi: 10.3784/jbjc.202103230145

鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价

doi: 10.3784/jbjc.202103230145
基金项目: 新疆维吾尔自治区自然科学基金(No. 2018D01C089)
详细信息
    作者简介:

    李博,男,重庆市云阳县人,硕士,主管技师,主要从事自然疫源性传染病防控,Email:king-2032169@163.com

    通讯作者:

    王效俊,Tel:0991–2650698,Email:1366700944@qq.com

  • 中图分类号: R211; R516.8

Establishment and evaluation of internal control of multiplex quantitative PCR for detection of Yersinia pestis

Funds: This study was supported by the Natural Science Foundation of Xinjiang of China (No. 2018D01C089)
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  • 摘要:   目的  建立一种鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法,并进行应用效果评价。  方法  选择鼠疫菌染色体YPO0393基因与pMT1质粒caf1基因为靶基因,设计合成YPO0393-内标模板、特异性引物和TaqMan荧光探针,构建鼠疫多重荧光定量PCR内标检测体系;对非鼠疫菌DNA、不同稀释浓度鼠疫菌DNA、野外监测样本进行检测,评价该方法的特异性、灵敏性、重复性和应用效果。  结果  采用多重荧光定量PCR内标方法,8株鼠疫菌DNA均出现明显的扩增曲线,12株非鼠疫菌DNA未显示扩增曲线,提示该方法特异性良好。 不同浓度的鼠疫EV76疫苗株DNA,检测最低限为22.5×10−4 ng/μL,变异系数为0.99~3.42,提示灵敏性、重复性较好。 105份野外监测样本中,荧光定量PCR内标方法检测阳性的6份,与普通PCR方法检测结果一致,4份样本分离培养出鼠疫菌且采用PCR方法检测阳性。  结论  通过设置双靶基因与内标对照,本研究建立的鼠疫多重荧光定量PCR内标方法可降低检测假阳性率,特异性、灵敏性和重复性理想,可用于鼠疫快速检测。
  • 图  1  鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的特异性

    Figure  1.  Specific of internal control of multiplex quantitative PCR for detecting Y. pestis

    表  1  本研究所用菌株

    Table  1.   Strains used in study

    菌株数量(株)基因组DNA
    提取方式
    来源
    长尾黄鼠型鼠疫菌2试剂盒法长尾黄鼠
    灰旱獭型鼠疫菌2试剂盒法灰旱獭
    红旱獭型鼠疫菌2试剂盒法红旱獭
    大沙鼠型鼠疫菌1试剂盒法簇鬃客蚤
    鼠疫菌EV761酚氯仿法新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心保藏
    假结核耶尔森菌3试剂盒法新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心保藏
    小肠结肠炎耶尔森菌2试剂盒法新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心保藏
    伤寒沙门菌1试剂盒法临床患者粪便
    费氏志贺菌1试剂盒法临床患者粪便
    布鲁氏菌1试剂盒法临床患者血液
    铜绿假单胞菌1试剂盒法临床患者痰液
    大肠埃希菌1试剂盒法临床患者血液
    金黄色葡萄球菌1试剂盒法临床患者痰液
    溶血葡萄球菌1试剂盒法临床患者血液
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    表  2  本研究所用引物和探针

    Table  2.   Primers and probes used in study

    靶基因引物序列(5′~3′)探针序列(5′~3′)基因定位靶基因长度(bp)
    YPO0393F: CTTGATGAATTCAAGTCGGCTGTFAM-ATTCCCATATTGGAGCGCATC-TAMRA染色体105
    R: CCCACATGTATCCGCACAAAC
    caf1F: ATCAGTTCCGTTATCGCCATTGHEX-ACTATTGCAACTGCTAATG-TAMRApMT1质粒 81
    R: GCAGTGGTGCTTGCAGTTAA
    YPO0393-内标 ROX-AACAGGTAGGTACGAGC-TAMRA合成基因 85
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    表  3  采用多重荧光定量PCR方法检测不同浓度标准品的Ct

    Table  3.   Ct values for detecting standard samples at different concentrations using multiplex quantitative PCR

    模板DNA浓度
    (ng/μL)
    目标基因Ct
    YPO0393caf1YPO0393内标
    22.5×10020.1720.5420.55
    22.5×10−124.6023.9620.73
    22.5×10−227.4127.0519.57
    22.5×10−332.1329.9021.02
    22.5×10−434.7234.3520.58
    22.5×10−537.0736.8320.27
    22.5×10−620.60
    注:–. 无Ct
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    表  4  采用多重荧光定量PCR法检测不同浓度标准品的Ct值及变异系数

    Table  4.   Ct and CV for detecting standard samples at different concentrations using multiplex quantitative PCR

    标准品浓度

    (ng/μL)
    检测
    次数
    Ct值($\bar x \pm {{s} }$)Ct值变异系数(%)
    YPO0393caf1YPO0393caf1
    22.5×100520.12±0.2020.63±0.330.991.60
    22.5×10−1524.08±0.3224.36±0.571.332.34
    22.5×10−2527.92±0.5426.88±0.921.933.42
    22.5×10−3532.05±0.6830.30±0.622.122.04
    22.5×10−4533.95±0.7234.12±0.822.122.40
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-23
  • 网络出版日期:  2022-04-01
  • 刊出日期:  2022-05-31

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